Bibliogr. s. 25-27

Błona komórkowa stanowi podstawową barierę dla infekcji wirusowej, a obecność konkretnych białek na jej powierzchni determinuje specyficzność tkankową i gatunkową wirusa. Aby ją przekroczyć, wirusy wykształciły liczne mechanizmy, których wykorzystanie zależne jest od budowy wirusa oraz komórki docelowej. Wirusy opłaszczone generalnie ulegają fuzji z błoną komórkową, co skutkuje przeniesieniem nukleoproteiny do wnętrza komórki. Proces ten może nastąpić na powierzchni komórki, jednak bardzo często jest poprzedzony internalizacją, w której wykorzystywane są naturalne mechanizmy komórkowe służące w warunkach fizjologicznych między innymi do odżywiania się, czy odbierania cząsteczek sygnałowych. Przedmiotem prezentowanych badań są dwa wirusy wywołujące choroby u człowieka. Pierwszy z nich, ludzki koronawirus OC43 (HCoV-OC43, od ang. human coronavirus OC43), jest częstą przyczyną chorób górnych i dolnych dróg oddechowych o cięższym przebiegu u dzieci, osób starszych oraz z niedoborem odporności. Drugim wirusem wybranym do badań jest wirus Zika (ZIKV, od ang. Zika virus). Choć choroba związana z tym flawiwirusem jest łagodna lub asymptomatyczna, zakażenie może prowadzić do rozwoju zespołu Guillaina-Barrégo (autoimmunologicznego uszkodzenia nerwów) u dorosłych i małogłowia u noworodków. Choć każdy z tych wirusów wykorzystuje inną ścieżkę wejścia, to ostatecznie obydwu udaje się przedostać do wczesnych endosomów, a fuzja ich otoczek z błoną pęcherzyków komórki gospodarza silnie zależy od niskiego pH. W ramach przeprowadzonych badań opisano drogi wejścia obydwu wirusów do komórki gospodarza. Podczas gdy HCoV-OC43 inicjuje klasyczną, stosunkowo wolną (około 90 min) drogę kaweolinozależną, ZIKV wnika do komórek drogą klatrynozależną i ulega fuzji już po 10-15 min. Zastosowanie mikroskopii konfokalnej umożliwiło obserwację kolokalizacji białek wirusowych z białkami markerowymi poszczególnych przedziałów komórkowych. W efekcie byliśmy w stanie śledzić trasę pojedynczych wirionów w początkowej fazie zakażenia komórki. Znaczenie poszczególnych białek w tym procesie zostało następnie potwierdzone poprzez zahamowanie ich aktywności z wykorzystaniem selektywnych inhibitorów lub poprzez wyciszenie wyrażania poszczególnych białek przy pomocy małych interferujących RNA. W związku z tym, że proces internalizacji obydwu wirusów jest wrażliwy na zmiany pH, inkubacja komórek z czynnikami zwiększającymi wewnątrzkomórkowe pH (bafilomycyna A1 oraz NH4Cl) również prowadziła do zahamowania infekcji. Bafilomycyna A1 jest inhibitorem pompy protonowej i hamuje obniżanie pH w przedziałach wewnątrzkomórkowych, natomiast chlorek amonu działa buforująco, neutralizując zakwaszenie endosomu. Oba te związki są złotym standardem stosowanym w badaniach nad endocytozą i uważa się, że ich działanie polega na hamowaniu procesu fuzji poprzez zablokowanie zmian strukturalnych indukowanych niskim pH. W takim scenariuszu w obu przypadkach powinno dochodzić do zatrzymania procesu fuzji, a wirusy powinny wejść na ścieżkę degradacji i zostać usunięte z komórki. Przeprowadzone badania wykazały, że w przypadku bafilomycyny A1 faktycznie realizowany jest ten scenariusz, jednak w obecności chlorku amonu uzyskane wyniki były niezgodne z teorią. Bezsprzecznie wykazaliśmy, że chlorek amonu działa w sposób całkowicie odmienny od opisanego, zmieniając transport wewnątrzkomórkowy i prowadząc do usunięcia wirionów zaraz po wejściu do przedziału endosomalnego poprzez szybki recykling zależny od Rab35. Uzyskane wyniki podważają jeden z paradygmatów w wirusologii i biologii komórki i pozwalają sądzić, że duża część badań dotyczących wczesnych etapów zakażenia wymaga weryfikacji. Przeprowadzone badania pozwoliły lepiej zrozumieć proces zakażenia wirusami HCoV-OC43 i ZIKV, a w przyszłości mogą przyczynić się do opracowania lepszych strategii terapeutycznych w zakresie opracowania inhibitorów wejścia.

Although plasma membrane is the primary barrier to viral infection, its composition and the presence of particular proteins on the cell surface determine the possibility of virus entry and, in consequence, tissue and species specificity of the virus. Enveloped viruses have developed different strategies of fusion with host cell membranes, which allows them to deliver their genetic material to the replication site. Subsequent to binding, some viruses are able to fuse with the host membrane immediately on the cell surface, while others need to be delivered to a precisely defined intracellular location. In the latter case, viruses hijack inward transport machinery, that in physiological conditions serves the cell for nutrition and communication. The main goal of this study was to identify and characterize the entry pathways of two viruses that pose a significant risk to human health. Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43) frequently causes upper and lower respiratory tract disease, which may take a more severe course in children, the elderly and immunocompromised people. Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne flavivirus, that is usually associated with mild infections manifested by a set of unspecific symptoms, such as fever, rash, conjunctivitis, muscle and joint pain, malaise and headache. However, in some cases neurologic complications may occur, leading to the development of Guillain-Barré syndrome in adults and lethal microcephaly in fetuses. HCoV-OC43 was found to initiate infection via relatively slow (~90 min) caveolin-dependent pathway, whereas ZIKV was found to follow clathrin-dependent endocytosis and to undergo fusion as soon as 10-15 min post inoculation. Using confocal microscopy, we were able to observe co-localization between viral proteins and marker proteins of different intracellular compartments, which allowed us to track single virions during the early phase of infection. The results were further verified using small interfering RNA to transiently silence the expression of proteins involved in the chosen internalization processes, and also by using selective chemical inhibitors of these pathways. As far as the internalization process of both viruses is endocytosis-dependent and thus is sensitive to pH changes, incubation of the virus-overlaid cells with pH-increasing agents hampered the infection development. Bafilomycin A1 is a proton pump inhibitor which suppresses the pH decrease in intracellular compartments, whereas NH4Cl exhibits a simple buffering function and in this way neutralizes the acidification of endosomes. Both of the compounds are golden standards in the research of endocytosis process; by now, it has been commonly believed that their inhibitory function relies on the blocking of structural changes that in physiological (low pH) conditions induce fusion process. In such a scenario, both agents would inhibit the fusion between the viral envelope and the host membrane, which would further lead the virus to the degradation pathway. Although such a pattern has been indeed observed in the case of bafilomycin A1-treated cells, the results obtained for NH4Cl are significantly different. We have demonstrated that NH4Cl reprograms the endocytic hub so that virions are immediately ejected from endosomal compartment via Rab35-driven fast recycling pathway. These data call into question one of the paradigms in virology and cell biology and suggest that much of the research on the early stages of infection requires verification. The complex research on mechanisms of HCoV-OC43 and ZIKV trafficking presented in this study shed light on the regulation of intracellular transport and helped to understand viral strategies of host cells deception. In a broader perspective, identification of cellular factors indispensable for the early steps of infection is going to contribute to the development of novel antiviral therapies.