The impact of sumoylation on phototropin controlled reactions

Bibliogr. s. 107-123

Światło jest kluczowym czynnikiem dla wzrostu i rozwoju roślin. Rośliny mają zdolność do reagowania na światło dzięki wyspecjalizowanym fotoreceptorom. Fototropiny są receptorami zaangażowanymi w odpowiedzi roślin na światło niebieskie i UVA. W genomie A. thaliana zidentyfikowano 2 geny kodujące fototropiny - PHOT1 i PHOT2. Fototropiny zaangażowane są w regulację fototropizmu, ruchów chloroplastów, otwierania aparatów szparkowych i pozycjonowania liści. W słabym świetle, w wyniku reakcji akumulacji, chloroplasty przemieszczają się pod ściany komórkowe prostopadłe do kierunku padania światła przyjmując tzw. położenie płaskie umożliwiające optymalizację absorpcji dostępnego światła. Reakcja ucieczki skutkuje położeniem profilowym chloroplastów pod ścianami równoległymi do kierunku padania światła. W tym położeniu chloroplasty unikają ekspozycji na silne światło zmniejszając jednocześnie prawdopodobieństwo uszkodzenia aparatu fotosyntetycznego. Obie fototropiny wspólnie kontrolują reakcję akumulacji chloroplastów pod wpływem światła o słabym natężeniu, ale tylko phot2 bierze udział w reakcji ucieczki chloroplastów wywołanej silnym światłem. Sumoilacja jest modyfikacją potranslacyjną polegającą na odwracalnym przyłączeniu do modyfikowanego białka małego białka SUMO (SMALL UBIQUITIN RELATED PROTEIN). Modyfikacja ta może blokować lub aktywować białka, zmieniać ich lokalizację i wpływać na interakcje. Sumoilacja może też ochraniać białka przed skierowaniem ich do degradacji. Warunki stresowe skutkują tworzeniem koniugatów z białkiem SUMO. Znaczenie tej modyfikacji pozostaje jedynie częściowo wyjaśnione. W roślinach sumoilacja pośrednio wpływa na rozwój, kwitnienie oraz strukturę korzeni. Genom Arabidopsis koduje 8 izoform SUMO, jednak większość prowadzonych badań dotyczy SUMO1, SUMO2, SUMO3 i SUMO5, ponieważ dla tych form znaleziono EST (Expressed Sequence Tags). Najważniejsze fizjologicznie są izoformy SUMO1 i SUMO2, gdyż podwójny mutant Atsum1sum2 jest letalny. Obie izoformy SUMO odpowiadają za reakcję na stres cieplny i solny u roślin. W genomie Arabidopsis zidentyfikowano cztery ligazy SUMO biorące udział w procesie sumoilacji: SIZ1 (SAP AND MIZ1), MMS21 (METHYL METHANE SULFONATE SENSITIVITY 21), PIAL1 i PIAL2 (PROTEIN INHIBITOR OF ACTIVATED STAT LIKE1 i 2). Ostatnio wykazano, że receptor światła czerwonego - fitochrom B jest sumoilowany poprzez przyłączenie SUMO1. W naszym laboratorium wykazano natomiast sumoilację Nkońcowej części fototropiny2. Głównym celem przeprowadzonych badań było sprawdzenie czy fototropina1 oddziałuje z białkami z rodziny SUMO oraz z ligazami uczestniczącymi w procesie sumoilacji. Druga część pracy dotyczyła wpływu sumoilacji na reakcje fizjologiczne kontrolowane przez fototropiny. Przeprowadzono analizy bioinformatyczne potwierdzające występowanie sekwencji aminokwasów o wysokim prawdopodobieństwie sumoilacji w obrębie PHOT1. Scharakteryzowano oddziaływania fototropiny1 z elementami szlaku sumoilacji metodą komplementacji fluorescencji (BiFC) in planta. W niniejszej pracy po raz pierwszy wykazano jądrową lokalizację fototropiny1 w oodziaływaniu z ligazą SIZ1. Dowiedziono, że po rekonstytucji systemu sumoilacji w E. coli, N-końcowy fragment fototropiny1 ulega modyfikacji przez białka SUMO. Sprawdzono również poziom ekspresji białek fototropin w liściach mutantów pozbawionych poszczególnych elementów szlaku sumoilacji: Atsum1, Atsum2, Atsum3, Atsum5, Atsiz1, Atmms21, Atpial1 i Atpial2. We wszystkich badanych mutantach ligaz z wyjątkiem Atpial2 zaobserwowano obniżoną ilość białka PHOT1 w porównaniu do Arabidopsis dzikiego typu zarówno w ciemności jak i na świetle. Mutant Atmms21 charakteryzuje się podwyższoną ilością PHOT2, natomiast mutant Atsiz1 wykazuje obniżony poziom tego białka w porównaniu do Arabidopsis dzikiego typu. Wyższy poziom białek - fototropiny1 i fototropiny2 - zaobserwowano również w mutancie Atsum5. Celem określenia fizjologicznej roli sumoilacji fototropin zbadano reakcje fizjologiczne kontrolowane przez fototropiny: indukowany światłem niebieskim ruch chloroplastów i fototropizm. Badania zostały przeprowadzone z użyciem mutantów szlaku sumoilacji oraz mutantów podwójnych, fototropinowych i ligazowych (Atphot1mms21, Atphot1siz1, Atphot2mms21, Atphot2siz1). W przypadku ruchów chloroplastów wykazano słabszą odpowiedź mutanta Atphot1mms21 na krótkie impulsy światła w porównaniu do Atphot1 oraz silniejszą odpowiedź na krótkie impulsy w Atphot1siz1. Zatem ligazy te wpływają na reakcje kontrolowane przez fototropinę2. Mutanty Atphot2mms21 i Atphot2siz1 wykazały słabszą niż Atphot2 akumulację w odpowiedzi na światło ciągłe, co sugeruje, że ligazy wpływają także na odpowiedzi zależne od phot1. Analizując kąt wygięcia fototropicznego siewek wykazano słabszy fototropizm w mutantach Atmms21, Atsiz1 i Atpial1 przy niskim natężeniu światła (0,01 μmol m-2 s-1) w porównaniu do Arabidopsis dzikiego typu, co może być związane z niższym poziomem PHOT1 w tych mutantach. Mutant Atpial2 wykazuje silniejszy fototropizm w stosunku do Arabidopsis dzikiego typu przy niskim natężeniu światła, może być to związane z wyższym poziomem PHOT1 w tym mutancie na świetle. Mutanty Atphot1mms21 i Atphot1siz1 wykazują słabszy fototropizm przy wyższym natężeniu światła (5 μmol m-2 s-1) niż rośliny dzikiego typu i mutanty pojedynczych genów ligaz, co świadczy o tym, że reakcja kontrolowana przez phot2 jest słabsza przy braku ligaz MMS21 lub SIZ1. Badania przeprowadzone w niniejszej pracy doktorskiej pozwalają na stwierdzenie, że phot1 jest substratem do modyfikacji przez białka SUMO. PHOT1 w oddziaływaniu z ligazą SIZ1 przyjmuje lokalizację jądrową. Elementy szlaku sumoilacji wpływają na poziom ekspresji białek fototropin zarówno w ciemności, jak i na świetle. Białka SUMO i ligazy sumoilacji regulują (bezpośrednio lub pośrednio) odpowiedzi fizjologiczne kontrolowane przez fototropiny, w szczególności fototropizm.

Light plays an important role in plant's growth and development. Plants perceive light through specialized proteins called photoreceptors. Phototropins perceive blue and UVA light. Two genes have been identified in the Arabidopsis genome: PHOT1 and PHOT2. Phototropins are involved in phototropic bending, stomatal opening, leaf positioning and chloroplast movements. In weak blue light, chloroplasts move to periclinal walls in order to optimize light absorption. This is called the chloroplast accumulation response. In strong blue light, the avoidance response is observed as chloroplasts move away to the anticlinal walls in order to minimize damage of photosynthetic apparatus. Both phototropins control chloroplast accumulation response, but only phot2 regulates the avoidance response. Sumoylation is a posttranslational modification which results in a reversible attachment of a small SUMO (SMALL UBIQUITIN RELATED PROTEIN) protein to target proteins. Sumoylation can block or activate other proteins through changing their localization and interactions. Stress conditions result in SUMO conjugates formation. The importance of this modification is only partially discovered. Sumoylation regulates plant development, flowering and root structure. 8 SUMO isoforms are encoded in the Arabidopsis genome. Only isoforms SUMO1, SUMO2, SUMO3, SUMO5 are investigated, since their EST (Expressed Sequence Tags) have already been identified. Both isoforms SUMO1 and 2 are crucial for plant's life. The double Atsum1sum2 mutant is lethal. Isoforms SUMO1 and SUMO2 are responsible for heat and salt stress responses in plants. Four SUMO ligases have been identified in the Arabidopsis genome so far: SIZ1 (SAP AND MIZ1), MMS21 (METHYL METHANE SULFONATE SENSITIVITY 21), PIAL1 and PIAL2 (PROTEIN INHIBITOR OF ACTIVATED STAT LIKE1 and 2). It has been demonstrated that phytochrome B - a red light receptor is sumoylated by SUMO1. In our laboratory it has been shown that the N-terminus of phototropin2 is also sumoylated. The main objective of experiments performed in this thesis was to verify whether phototropin1 interacts with the SUMO protein family and SUMO ligases. The second part of the study focused on physiological responses controlled by phototropins. Bioinformatic analysis confirmed the occurrence of amino acid sequences with a high probability of sumoylation within PHOT1. Interactions between phototropin1 and proteins involved in the sumoylation pathway were characterized using the Bimolecular Fluorescence Complementation technique. In this work the nuclear localization of phototropin1 promoted by the interaction with SIZ1 was shown for the first time. It was also confirmed that the Nterminus of phototropin1 is modified by SUMO proteins using a sumoylation system reconstituted in E. coli. The levels of phototropin proteins were tested in mature leaves of wild-type Arabidopsis and the following mutants: Atsum1, Atsum2, Atsum3, Atsum5, Atsiz1, Atmms21, Atpial1 and Atpial2. Except for Atpial2, all tested mutants revealed lower levels of PHOT1 in comparison to the wild type, in both light and dark. The Atmms21 mutant exhibited higher PHOT2 levels, whereas the Atsiz1 mutant showed lower levels of PHOT2 in comparison with AtWT. Higher levels of both phototropins were found in the Atsum5 mutant. In order to determine the physiological role of phototropin sumoylation, light induced chloroplast movements and phototropism were investigated. Both responses are phototropin controlled. Experiments were performed using sumoylation pathway mutants and double - phototropin and ligase mutants (Atphot1mms21, Atphot1siz1, Atphot2mms21, Atphot2siz1). Weaker responses of chloroplasts to short blue light pulses were observed in the Atphot1mms21 mutant and stronger responses in Atphot1siz1, both in comparison to Atphot1. The conclusion is that ligases may influence phot2 controlled reactions. Both Atphot2mms21 and Atphot2siz1 mutants showed weaker accumulation in response to continuous blue light in comparison to Atphot2. This suggests that ligases may influence phot1 controlled responses. Phototropic curvature analysis showed weaker phototropism in mutants: Atmms21, Atsiz1 and Atpial1 under low light intensity (0,01 μmol m-2 s-1) than in wild type plants. This can be related to lower levels of PHOT1 observed in these mutants. The Atpial2 mutant exhibits stronger phototropism than AtWT in weak light, which may be related to higher PHOT1 levels in this mutant under light. Atphot1mms21 and Atphot1siz1 mutants showed weaker phototropism in higher light intensities (5 μmol m-2 s-1) than wild type plants or single ligase mutants. This suggests that the reaction controlled by phot2 is weaker in the absence of MMS21 or SIZ1 ligases. Experiments performed in this thesis enable to conclude that phot1 is modified by members of the SUMO protein family. PHOT1 can localize in the nucleus as a result of the interaction with SIZ1. Proteins involved in the sumoylation pathway influence the level of phototropin proteins in both dark and light. SUMO proteins and SUMO ligases regulate (directly or indirectly) physiological responses controlled by phototropins, especially phototropism.