Selected properties of vitamin D3 as a factor supporting the treatment of melanomas

Bibliogr. s. 99-114

Witamina D3 jest nie tylko niezbędna dla gospodarki wapniowo fosforanowej. Ma również wpływ na proliferację i różnicowanie komórek prawidłowych jak i nowotworowych. Mechanizm działania witaminy D3 nie jest do końca poznany, ale wiadomo, że za wpływ pochodnych witaminy D3 odpowiedzialny jest jeden z rodziny receptorów jądrowych. Jest to receptor witaminy D3. Jego ekspresję odkryto w wielu prawidłowych tkankach, ale i również w komórkach nowotworów, tj. rak piersi, czerniak skóry. Potwierdzono, że biologicznie aktywna witamina D3 oraz jej pochodne mają antynowotworowy wpływ na komórki ludzkiego czerniaka skóry. Potwierdzono również korelację pomiędzy ekspresją receptora witaminy D a upigmentowaniem i stadium zaawansowania czerniaka. Jak dotąd nie było opublikowanych badań na temat wpływu witaminy D3 i jej pochodnych na nowotwór czerniaka błony naczyniowej oka. W tej pracy badałam biologicznie aktywną witaminę D3 i jej pochodne jako adiuwant w terapii czerniaka błony naczyniowej, w tym terapii protonowej. W tym celu sprawdzono biologicznie aktywną witaminę D3 oraz jej metabolit jako czynniki zwiększające radioczułość ludzkiego (SKMel-188) oraz chomiczego czerniaka skóry (BHM Ma, BHM Ab). Wybrane linie komórkowe były inkubowane z różnymi stężeniami 1,25(OH)2D3 oraz 25(OH)D3 (w stężeniu 0, 10-8 oraz 10-7M) na 24 godziny przed napromienianiem (0, 1, 3 i 5 Gy). Po napromienieniu komórki wysiewano w czystym medium hodowlanym i liczono przez 4 kolejne dni. Sprawdzono również ekspresję receptora witaminy D w pobranych tkankach od pacjentów z czerniakiem błony naczyniowej. Tkanki zostały wybarwione metodami immunohistopatologicznymi w Zakładzie Patologii nowotworów i Patomorfologii Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Bydgoszczy. Kolejnym krokiem było wyciszenie receptora witaminy D w komórkach ludzkiego czerniaka skóry (WM164) metodą CRISP. Przeprowadzono badania na linii z wyciszoną ekspresją oraz kontrolą sprawdzające wpływ na proliferację, migrację, zdolność do tworzenia kolonii oraz sferoidów. Ostatnim krokiem było sprawdzenie wpływu związków witaminy D3 (1,25(OH)2D3, 25(OH)D3, 1,20(OH)2D3 oraz 20(OH)D3) na wybrane linie ludzkiego czerniaka błony naczyniowej (Mel270 i 92.1). Również przeanalizowano wpływ na proliferację i zdolność do tworzenia kolonii oraz sferoidów. Otrzymane wyniki sugerują, że biologicznie aktywna witamina D3 oraz jej metabolit mogą zwiększać radioczułość komórek czerniaka skóry w zależności od podanego stężenia oraz dawki promieniowania. Czerniak błony naczyniowej jest zdolny do ekspresji receptora witaminy D. Ekspresja ta jest odwrotnie proporcjonalna do upiegmentowania nowotworu. Co potwierdza również wyniki otrzymane po wyciszeniu ekspresji VDR, w komórkach ludzkiego czerniaka skóry. Linia stała się bardziej agresywna. Zwiększone było tempo proliferacji, migracja oraz zdolność tworzenia kolonii. Niestety wyniki nie sugerują jednoznacznie, że kalcytriol i jego pochodne mogą zostać wykorzystane w terapii czerniaka błony naczyniowej oka.

Vitamin D3 is not only essential for metabolism of calcium and phosphate, it also affects the proliferation and differentiation of normal and malignant cells. The mechanism of action of vitamin D3 is not fully understood, but it is known that the nuclear vitamin D receptor (VDR) of the family of nuclear receptors is responsible for its effect of its derivatives. The VDR expression has been found not only in normal tissues but also in tumor cells, i.e. breast cancer, skin melanoma. It has been confirmed that biologically active vitamin D3 and its derivatives have an anti-cancer effect on human skin melanoma cells. The correlation between vitamin D receptor expression, pigmentation and melanoma stage was also confirmed. However, there is lack of published information on the influence of vitamin D3 and its derivatives on the uveal melanoma. In this work, I proposed that biologically active forms of vitamin D3 and its derivatives can act as an adjuvant in the treatment of uveal melanoma, including the proton beam therapy. For this purpose, biologically active form of vitamin D3 and its metabolite were tested as factors increasing the radio-sensitivity of human and hamster skin melanomas. Selected cell lines were incubated with various concentrations of 1.25(OH)2D3 and 25(OH)D3 for 24 hours before irradiation, then irradiated, seeded and counted for subsequent days. The expression of the vitamin D receptor in collected tissues from patients with uveal melanoma was also tested. The tissues were stained by immunohistopathological methods in the Department of Tumor Pathology and Pathomorphology at Nicolaus Copernicus University in Bydgoszcz. We also silenced the vitamin D receptor in human skin melanoma cells by the CRISP method. Further studies were performed on the line with silenced or intact VDR (control), and cell proliferation, migration, colony and spheroids forming abilities were tested. The effect of vitamin D3 derivatives on proliferation and the ability to form colonies and spheroids by selected lines of human uveal melanoma was also tested. The results suggest that the biologically active vitamin D3 and its metabolite have a potential to increase the radio-sensitivity of skin melanoma cells, depending on the given concentration and radiation dose. The human uveal melanoma is capable of expressing the vitamin D receptor. This expression is inversely proportional to the pigmentation of the tumor. The function of VDR as tumor suppressor is suggested by the results obtained after silencing the expression of this receptor in human skin melanoma cells. The line became more aggressive. They show more aggressive behavior, have increased proliferation potential, migration rate and the abilities to form colonies. Unfortunately, the results from the studies on established uveal melanoma lines on in vitro anticancer activities of calcitriol and its derivatives were negative.