Biobetter reagents for blood typing : studies on the properties of agglutinating mouse IgG3 and IgM antibodies

Bibliogr. s. 16-17

Przeciwciała IgM pełnią kluczową rolę w humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Cząsteczki te ze względu na swoje właściwości stały się także przedmiotem zainteresowania przemysłu biotechnologicznego. Przeciwciała IgM rozpoznające antygeny powierzchniowe czerwonych krwinek wywołują hemaglutynację. Reakcja ta polega na zlepianiu krwinek w agregaty i pozwala szybko ocenić obecność danego antygenu na krwinkach. Dzięki swoim właściwościom przeciwciała IgM są szeroko wykorzystywane w diagnostyce grup krwi. Ponadto ze względu na wysoki potencjał cytotoksyczny postrzega się je również jako bioterapeutyki nowej generacji, które w przyszłości mogą zostać użyte m.in w leczeniu nowotworów. Przeciwciała IgM są oligomerami o masie cząsteczkowej sięgającej 1 MDa z bogatą glikozylacją i dziesiątkami mostków disiarczkowych. Złożona budowa sprawia, że przeciwciała IgM są niestabilne, szybko tracą aktywność i trudno je produkować. Cechy te w konsekwencji negatywnie wpływają na jakość odczynników diagnostycznych opartych na przeciwciałach IgM. W swojej pracy doktorskiej badałem przyczyny niestabilności przeciwciał IgM oraz starałem się opracować odczynniki diagnostyczne o poprawionej trwałości. Moje badania dotyczyły mysich przeciwciał monoklonalnych, które są powszechnie wykorzystywane do oznaczania antygenów układu grupowego ABO. Jednym z najważniejszych osiągnięć mojej pracy było scharakteryzowanie nieznanego dotychczas sposobu degradacji mysich przeciwciał IgM polegającego na nieenzymatycznej proteolizie. Na podstawie otrzymanych wyników zaprojektowałem i uzyskałem zmutowane przeciwciała IgM, które nie ulegały opisanej przeze mnie fragmentacji i cechowały się zwiększoną stabilnością. Ponadto nasz zespół nieoczekiwanie uzyskał aglutynujące mysie przeciwciała IgG3. Przeprowadzone przeze mnie analizy wykazały, że są one znacznie stabilniejsze niż przeciwciała IgM i mogą stać się atrakcyjną alternatywą dla stosowanych obecnie odczynników diagnostycznych do oznaczania grup krwi. Przeciwciała IgG były dotychczas postrzegane jako zbyt małe, by móc jednocześnie związać antygeny na dwóch czerwonych krwinkach i wywołać hemaglutynację. W swojej pracy wykazałem jednak, że przeciwciała IgG3, jako jedyne spośród czterech podklas mysich IgG, wywołują hemaglutynację w bardzo niskich stężeniach. To odkrycie zachęciło mnie do próby wyjaśnienia mechanizmu hemaglutynacji zależnej od IgG3. Zbadałem wpływ poszczególnych domen mysich przeciwciał IgG3 na ich zdolność do hemaglutynacji, oligomeryzacji i wiązania poliwalentnych antygenów z wysokim powinowactwem. Uzyskane w ramach pracy zmutowane przeciwciała IgM oraz przeciwciała IgG3 są dwoma rodzajami innowacyjnych odczynników diagnostycznych o poprawionej stabilności.

Antibodies of IgM class play a crucial role in humoral immunity. The properties of IgM are also within the interest of biotech industry. IgMs specific to a particular antigen present on the surface of erythrocytes trigger hemagglutination. This reaction of erythrocyte aggregation enables rapid identification of antigens present on the cells. Thus, IgMs are commonly used in blood typing. Moreover, IgMs are considered as next generation biotherapeutics that may be useful in cancer treatment because of their high cytotoxic potential. IgM is a heavily glycosylated oligomer with a molecular mass of about 1 MDa and it contains dozens of disulfide bonds. The complex structure of IgM adversely affects its stability and productivity. IgMs usually rapidly lose their activity during storage. Consequently, the quality of IgMbased diagnostic reagents is decreased. In my PhD project I investigated the stability of IgM molecules and I developed IgM- and IgG3-based biobetter reagents with improved durability. The subject of my project were mouse antibodies, which are worldwide used for typing of ABO blood group antigens. One of the achievements of my project was a discovery of a new non-enzymatic pathway of mouse IgM degradation. Based on my results I designed and generated mutated IgMs that were resistant to the discovered degradation pathway. These antibodies had increased stability in comparison to parental IgMs. Moreover, our team unexpectedly obtained agglutinating mouse IgG3 molecules that were more stable than IgMs. In the light of the results of my experiments, the IgG3 molecules may become an attractive alternative to the currently used reagents for blood typing. According to the general opinion, antibodies of IgG class cannot trigger hemagglutination because they are too small to simultaneously bind antigens on two erythrocytes. However, in my experiments I proved that IgG3s elicit hemagglutination even at a very low concentration. In contrast, other mouse IgG subtypes did not agglutinate erythrocytes. This discovery encouraged me to investigate a mechanism of IgG3-dependent hemagglutination. I elucidated how particular domains of mouse IgG3 influence hemagglutination, antibody oligomerization and affinity to polyvalent antigens. The developed IgG3 molecules and mutated IgMs are two types of innovative blood typing reagents with improved stability.