Analiza tkanek miażdżycowych oraz komórek przy użyciu obrazowania spektroskopią oscylacyjną oraz chemometrii

Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Nowoczesne techniki spektroskopowe stanowią ważne narzędzie w rękach badacza i dają zdolność przestrzennego obserwowania składu chemicznego próbki. Szczególnie dwie metody obrazowania oferują dużą ilość informacji chemicznej, tj. spektroskopia ramanowska i absorpcyjna w podczerwieni (IR). Dlatego też korzystne wydaje się zastosowanie tych technik w systemie, w którym dystrybucja przestrzenna składników chemicznych ma znaczenie. Miażdżyca została wybrana jako przedmiot badań ponieważ jest chorobą o dużym znaczeniu dla całego społeczeństwa. Skład lipidowy w blaszkach miażdżycowych zmienia się radykalnie podczas rozwoju choroby, co można badać na dostępnych modelach zwierzęcych tej choroby, a mianowicie na myszach transgenicznych ApoE/LDLR-/-. Ponieważ dziedzina obrazowania spektroskopowego tkanek i komórek wciąż się rozwija, optymalizacja metodologii prowadzanych pomiarów jest bardzo istotna. W pracy scharakteryzowano standardy lipidowe a następnie zidentyfikowano różne grupy lipidów w tkance miażdżycowej. Zaobserwowano heterogeniczność w dystrybucji cholesterolu i estrów cholesterolu w blaszkach u myszy ApoE/LDLR--. Następnie, przeprowadzono analizę profilu białkowego i struktur drugorzędowych białek, dla których został stworzony model przewidywania zawartości za pomocą Liniowej Regresji Wielokrotnej. Kolejnym krokiem była analiza progresji choroby. Opracowano metodę opartą na obrazach FT-IR dla ilościowego określenia wielkości blaszek miażdżycowych i porównano j ą z klasycznym barwieniem czerwienią oleistą (ORO), uzyskując wysoki współczynnik korelacji (R2 = 0,935). Następnie, stosując dwuetapowe podejście Analizy Skupień (CA), uzyskano wgląd w zmiany chemiczne w blaszce miażdżycowej podczas progresji choroby. Na koniec, przeprowadzono pierwszy etap wizualizacji zmian chemicznych spowodowanych dietą w blaszce i skorelowano z mapami uzyskanymi z obrazowania ramanowskiego i z mikroskopii sił atomowych (AFM). Dokonano ulepszeń w technice pomiaru w metodzie osłabionego całkowitego wewnętrznego odbicia (ATR). Przeprowadzono badanie wpływu nacisku kryształu podczas pomiaru na stan pojedynczych komórek śródbłonka. Dodatkowo, zostały zaprojektowane nowe apertury optyczne w celu umożliwienia pomiarów obrazowania ATR o zmiennej głębokości penetracji. Przeprowadzono teoretyczne badania artefaktu związanego z falą stojącą pola elektrycznego (EFSW) na widma tkanki biologicznej. Oszacowano potencjalne skutki uśredniania artefaktu o różnym pochodzeniu wpływających na obniżenie stopnia zakłóceń związanych z EFSW na widma FT-IR.

Modern spectroscopic techniques provide a powerful tool in the hands of a researcher - the capability to spatially resolve chemical composition. Especially two imaging methods offer high amount of chemical information, i.e. Raman and infrared (IR) imaging. Therefore, it is desirable to employ these techniques in a system, which would benefit from studying the spatial distribution of chemical components. Atherosclerosis was chosen as a disease to study, due to its high significance for the whole population. Lipid composition of the atherosclerotic plaques changes dramatically during the development of the disease, which can be followed using available animal models of the disease, namely a double knockout ApoE/LDLR-/- mice. Since the field of bio-spectral imaging of tissues and cells is still developing, an optimization of the experimental methodology is very much required. Lipid standards were characterized and then related to their presence in the atherosclerotic tissue. The heterogeneity of cholesterol and cholesteryl esters distributions was observed in the plaques of ApoE/LDLR-/- mice. Afterwards, the analysis was focused on proteins profile and their secondary structures, for which a prediction model using Multiple Linear Regression was created. The next step was an analysis of the disease progression. First, a method based on FTIR images for quantification of the lesion size was developed and compared with classical Oil Red O staining (ORO), yielding a high correlation (R2=0,935) coefficient. Afterwards, using a two-step Cluster Analysis (CA) approach, an insight into chemical changes of the plaque during the progression of the disease was done. Finally, a first step of visualizing diet-induced changes in the plaque was done and combined with Raman and AFM images. Methodological improvements in the field of Attenuated Total Reflection (ATR) imaging were done. A study of effects of the pressure from crystal contact during the measurement on the state of single endothelial cells was performed. Additionally, new optical apertures were designed to enable ATR imaging measurements with variable penetration depth. A theoretical study on the importance of Electric Field Standing Wave (EFSW) optical artifact in biological tissue spectra was performed. An estimation of the potential effects of averaging indicated sources of lowering of the extent of the EFSW-caused distortions to the FT-IR spectra.