Application of gas chromatography coupled with mass spectrometry to determination of tetrahydrocannabinols for forensic purposes

Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Składniki czynne przetworów konopi wywołują różnorodne pozytywne albo negatywne odczucia. Niektóre z nich to ogólne zmniejszenie chęci do działania, niezdolność do pokonywania konfliktów, zamknięcie w sobie, oszołomienie, dezorientacja, halucynacje i lęki z atakami paniki (psychozy), pasywność, apatia, zmęczenie, gonitwa myśli, zaburzenia zdolności koncentracji, uwagi i krytycznego myślenia, zaburzenia poczucia czasu oraz krótkotrwałej pamięci. Działanie THC utrzymuje się dłużej niż występuje jego mierzalne stężenie w płynach ustrojowych. Doznania odczuwane przez palacza trwają przez trudny do określenia czas. THC stwarza również duże trudności analityczne i interpretacyjne z wielu powodów. Oddziałuje na organizm ludzki w małych dawkach, które prowadzą do występowania jego i produktów jego szybkiego metabolizmu w niskich stężeniach w płynach ustrojowych. THC i jeden z jego metabolitów (11-OH-THC) są aktywne, a drugi metabolit (THCCOOH) jest nieaktywny. THC i 11-OH-THC ulegają szybkiej eliminacji z organizmu, a THCCOOH ulega kumulacji. Obecność jednego, dwóch lub trzech związków w różnych rodzajach płynów ustrojowych pobranych od konsumentów przetworów konopi (najczęściej palaczy) ma różną wartość interpretacyjną w odniesieniu do określenia, czy palacz jest w stanie pod wpływem THC, czy w stanie po użyciu, co jest istotne z punktu widzenia obowiązujących aktów prawnych dotyczących kierowania samochodem. Głównym celem podjętych badań było opracowanie metody równoczesnego wykrywania i oznaczania THC oraz dwóch głównych jego metabolitów - 11-OH-THC i THCCOOH w płynach ustrojowych i jej weryfikacja w odniesieniu do międzynarodowych standardów. Charakterystykę metody przedstawiono w powiązaniu z jej zastosowaniem do oceny: stężeń tych związków we krwi i moczu pobranych od kierowców, stężeń środka psychoaktywnego i jego dwóch metabolitów w równocześnie pobranych próbach krwi, moczu i śliny od pacjentów oraz trwałości tych związków podczas przechowywania płynów ustrojowych do badań, a także wpływu procesów gnilno-rozkładowych zachodzących w materiale biologicznym na wynik oznaczania tych ksenobiotyków. W części teoretycznej wprowadzono czytelnika w zagadnienia, które pozwoliły w sposób systematyczny śledzić tok postępowania przy realizacji zadań opisanych w części doświadczalnej. Omówiono przetwory konopi w aspekcie historycznym, przybliżono podstawowe właściwości poszczególnych kannabinoli, ich nazewnictwo, stabilność podczas przechowywania. Przedstawiono znaczenie receptorów kannabinoidowych w przekazywaniu informacji i reakcji, objawy działania THC na organizm człowieka. Oddzielny rozdział poświęcono farmakokinetyce z uwzględnieniem procesów wchłaniania, dystrybucji, biotransformacji i wydalania. Zwrócono uwagę na powszechnie stosowane wzory konsumpcyjne oraz zastosowanie THC jako środka farmaceutycznego a także na konsekwencje zdrowotne jego używania. W rozdziale dotyczącym regulacji prawnych omówiono kolejne modyfikacje ustawy o przeciwdziałaniu narkomanii i obowiązujące ustawodawstwo dotyczące przetworów konopi w aspekcie analizy ich składników czynnych w materiałach biologicznych i nie biologicznych. Przegląd technik stosowanych obecnie do oznaczania kannabinoli w różnych materiałach biologicznych przedstawiono w zestawieniu tabelarycznym, a w końcowym rozdziale tej części scharakteryzowano poszczególne materiały. W części eksperymentalnej pracy przedstawiono szczegółowo proces optymalizacji opracowanej metody i jej walidację zgodną ze standardami obowiązującymi w międzynarodowej kontroli jakości badań. Pozytywna weryfikacja metodyki oznaczania THC i THCCOOH w czterech płynach ustrojowych pozwoliła na jej różne aplikacje. Metoda spełnia kryteria rozporządzenia Ministra Zdrowia z 2003 r. z późn. zm. do badania krwi kierowców na obecność THC, czyli jednego ze środków podobnie działających do alkoholu. Będzie również w pełni sprawna po zaostrzeniu wymogów dla metod analitycznych, czyli obniżeniu granicy analitycznej do 1 ng/ml, co jest obecnie postulowane przez polskich toksykologów sądowych zgodnie z tendencjami międzynarodowymi. Metoda jest użytecznym i niekwestionowanym narzędziem do oznaczania THCCOOH we krwi i w moczu. Pomimo, że obecność THCCOOH we krwi nie ma znaczenia o wnioskowaniu dotyczącym stanu kierowcy (po użyciu lub pod wpływem), ale wykazanie tego związku we krwi weryfikuje prawdziwość niskiego stężenia THC oraz wstępnie dodatniego wyniku uzyskanego metodami immunochemicznymi. Równoczesne oznaczanie THC i THCCOOH we krwi kierowców pozwala wnioskować o częstości przyjmowania przetworów konopi. Znajomość stężeń obu związków we krwi może służyć, chociaż w ograniczonym zakresie, do wyznaczenia czasu ostatniego przyjęcia kannabinoli na podstawie opublikowanych modeli matematycznych. Należy zaznaczyć, że to zagadnienie pozostaje w dalszym ciągu tematem kontrowersyjnym i wymaga dalszych badań. Analiza prób moczu pobranych od kierowców potwierdziła ograniczoną wartość wyniku analizy moczu na obecność tetrahydrokannabinoli dla celów sądowych. Niska LOQ dla THCCOOH opracowanej metody gwarantuje jej przydatność do kontroli abstynencji w leczeniu osób uzależnionych lub osadzonych. Zastosowanie tej samej metody do badania równocześnie pobranych trzech płynów ustrojowych od pacjentów umożliwiło ustalenie celowości wykonywania badań na obecność THC w ślinie, THC i THCCOOH we krwi oraz THCCOOH w moczu. Wykazano, że zmiany stężeń THC i THCCOOH w funkcji czasu w poszczególnych płynach ustrojowych charakteryzowały się dużą zmiennością osobniczą, ale nie dają podstaw do zaniechania przeprowadzenia analizy toksykologicznej na obecność tetrahydrokannabinoli nawet w czasie 24 h hospitalizacji osoby podejrzanej o przyjęcie przetworów konopi. Na podstawie oznaczania THC i THCCOOH u hospitalizowanych pacjentów w okresie trzygodzinnym wykazano spadek stężenia THC we krwi średnio o 18% wartości początkowej i wzrost stężenia THCCOOH średnio o 39%. Opracowana metoda pozwoliła na wykazanie niestabilności THC w roztworach wzorcowych, THC i wolnego oraz sprzężonego z kwasem glukuronowym THCCOOH podczas przechowywania płynów ustrojowych do badań, co wskazuje na konieczność właściwego przechowywania próbek do badań oraz potwierdzania wyników analizy dwiema niezależnymi metodami i/lub identyfikacji dwóch wskaźników przyjęcia przetworów konopi - macierzystego związku (THC) i jego metabolitu, nawet nieaktywnego (THCCOOH). Wdrożenie opracowanej metody do rutynowej praktyki eksperckiej ułatwi interpretację wyników toksykologowi analitykowi, diagnostykę zatruć lekarzowi z zakresu toksykologii, działalność opiniodawczą lekarzowi z zakresu medycyny sądowej i orzeczniczą organowi orzekającemu w sprawach o przyjęcie przetworów konopi i prowadzenie samochodu po ich przyjęciu, a także może być zastosowana do kontroli abstynencji w leczeniu osób uzależnionych lub osadzonych.

Active constituents of Cannabis lead to positive or negative symptoms. Some of them are: decreased activity for life, inability to overcome adversities, stupefaction, confusion, hallucination and fear with attacks of panic (psychosis), passivity, apathy, fatigue, flight of ideas, concentration disorder, attention disorder, lack of time sense. Activity of THC lasts longer than it is measured in body fluids. Personal feelings which affect the smoker are very hard to define. THC is also the compound which causes great analytical and interpretative problems. It interacts with organism at low doses, which produce extremely low concentrations in body fluid. This refers to THC and its metabolites produced by fast metabolism mechanism. THC and its major metabolite (11-OH-THC) are psychoactive, second metabolite (THCCOOH) is inactive. Both THC and 11-OH-THC are eliminated from the organism very fast. On the other side THCCOOH is being cumulated. Presence of one, two or three compounds in different kinds of body fluids collected form Cannabis consumers (mainly smokers) has various value for interpretation whether the consumer is or is not under the influence of THC, which is important from the legal point of view. Main reason to conduct this research was to establish a method for simultaneous detection and determination of THC and its two major metabolites - 11-OH-THC and THCCOOH in body fluids, and afterwards to verify it according to international standards. Full characterization of the method was presented through its applications. It was used to estimate concentrations of the compounds in blood and urine collected from drivers, concentrations of the psychoactive compound and its two major metabolites determined in simultaneously collected material: blood, urine and saliva taken from patients. At last estimation of the stability of THC and THCCOOH during storage of the material collected for analysis and influence of decay and putrefaction processes on the result of analysis. In the theoretical part of the dissertation, an introduction to issues was made, which lead in a systematic way to follow the procedure of realization of the goals described in experimental part. An introduction to Cannabis use from the historical point of view was the first thing, then basic chemical and psychical properties of particular cannabinoids as well as their nomenclature, stability during storage were described. Significance of the cannabinoid receptors taking part in transferring information and reactions after the administration of Cannabis was presented. Separate chapter was dedicated to pharmacokinetics with the special regards to absorption, distribution, biotransformation and excretion. Also a lot of attention was paid to the different ways of administration, application of THC as the active pharmaceutical compound, and finally health consequences of using it. In the chapter related to legal aspects, all amendments of the Act on Counteracting Drug Addiction of 29 July 2005 concerning Cannabis and obligatory legislation on any methods for determination of its active compounds in biological and non-biological materials were described. Review of techniques used for determination of cannabinoid in various biological materials was presented as a table, and in the final paragraph of the theoretical part particular biological materials were characterized. In experimental part of the dissertation detailed process of optimization of the elaborated method was presented. Afterwards validation was performed according to current international quality assurance standards. Positive verification of the methodology of THC and THCCOOH determination in four biological matrices lead to its wide application. The method meets the criteria of the Minister of Health Decree of 11 June 2003 (with subsequent amendments) on examination of drivers for the presence of THC in blood as one of the substance acting similarly to alcohol. It is also ready for the new legislation which is going to decrease the limits for analytical methods. It is proposed by Polish forensic toxicologists that the limit will be 1 ng/mL, what would meet the international trends. The method is a very useful and undoubtful tool for the determination of THCCOOH in blood and urine. Despite the fact that the presence of THCCOOH in blood is not of great value when distinguishing the states of drivers (after using from under the influence), it verifies reliably low THC concentrations as well as THC results obtained from immunochemical methods. Simultaneous determination of THC and THCCOOH in blood of drivers lets to evaluate the frequency of Cannabis preparations administration. Knowledge of both compounds (THC and THCCOOH) concentrations may in a limited range lead to establish the time of the last administration on the basis of published mathematical models. It is worth pointing out that establishment of the last Cannabis consumption still is a controversial matter and requires further research. Analysis of urine samples collected from drivers confirmed limited value of the results for urine analysis for forensic purposes. Low LOQ for THCCOOH in the elaborated method guarantees its usefulness for the control of abstinence in treatment of addicted or convicted people. Application of the same method for analysis of three different but simultaneously collected materials enabled the assignation of performing analysis for presence of THC in saliva, THC and THCCOOH in blood and THCCOOH in urine. It was proved that changes of THC and THCCOOH concentration in time in particular biological matrices were characterized by the high interindividual variability. However it does not give a basis to cease from toxicological analysis for the presence of tetrahydrocannabinols even after 24 h of hospitalization of a person suspected to administration of cannabis. On the basis of analysis conducted on materials collected after three hour periods of hospitalization, THC concentrations declined by 18% from its initial value whereas THCCOOH increased by mean of 39%. Elaborated method was used to show the instability of THC in standards, as well as THC and free and glucuronide conjugated THCCOOH in stored biological fluid samples. This points to a necessity of proper storage of samples and to confirm the results by two independent methods of determination and to identify at least two markers of Cannabis administration: parent compound - THC and the metabolite - THCCOOH. Implementation of the elaborated method to routine expert practice will facilitate the interpretation of results for forensic toxicologists, diagnosis of poisonings for physicians, and interpretation for forensic medicine doctors. It will also make easier to judge in cases concerning driving under the influence of THC, and also will enable the control of abstinence in treatment of addicted persons.