The mechanism of action of PBDE-47 and its hydroxylated metabolites in the ovary

Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Polibromowane difenyloetery (PBDE) to związki zmniejszające palność, które ze względu na swoje właściwości fizyko-chemiczne są zaliczane do grupy trwałych zanieczyszczeń organicznych. Charakteryzują się one dużą trwałością w środowisku i znaczną lipofilnością, co może stanowić istotne zagrożenie dla zdrowia człowieka. W 2004 r. Unia Europejska, w 2006 r. Stany Zjednoczone, a w 2007 r. także Chiny wprowadziły zakaz produkcji dwóch z trzech powszechnie stosowanych mieszanin PBDE, a mianowicie Penta- oraz Octa-BDE. Pomimo tego zakazu, pozostałości tych związków stwierdza się obecnie we wszystkich elementach środowiska, w tym również w tkankach pochodzących od człowieka, na całym świecie. Ponadto, PBDE wykazują zdolność do uwalniania się do środowiska z produktów, do których celowo zostały użyte, stanowiąc bezpośrednie zagrożenie dla zdrowia człowieka (z uwagi na ich działanie polegające na zaburzaniu równowagi hormonalnej). Badania prowadzone w Zakładzie Fizjologii i Toksykologii Rozrodu Uniwersytetu Jagiellońskiego wykazały, że jajnik jest docelową tkanką dla polibromowanych difenyloeterów. Dlatego celem niniejszej pracy doktorskiej było wyjaśnienie mechanizmu działania polibromowanych difenyloeterów w jajniku. Do badań wybrano wskaźnikowy kongener PBDE - BDE-47 i jego dwa hydroksylowane metabolity (5-OH-BDE-47 i 6-OHBDE-47). Modelem do badań były pęcherzyki jajnikowe pobrane z jajników dojrzałych płciowo świń. Prowadzono dwa typy hodowli: całych pęcherzyków oraz kokultur komórek warstwy ziarnistej oraz osłonki wewnętrznej pęcherzyka. Stosując metody immunoenzymatyczne (ELISA) określono wpływ badanych związków na sekrecję hormonów steroidowych oraz poziom enzymów II fazy metabolizmu. W obu przypadkach stosowano komercyjnie dostępne zestawy. Do pomiaru aktywności CYP1A1 oraz CYP2B1/2 zastosowano metody fluorescencyjne, natomiast do oznaczenia aktywności SULT1A i COMT zastosowano metody kolorymetryczne. Ekspresję genów szlaku steroidogenezy (HSD17B i CYP19A1), a także receptorów hormonów steroidowych (ESR1, ESR2 i AR) oraz receptorów związanych z metabolizmem zarówno hormonów steroidowych jak i ksenobiotyków (CAR i PXR (NR1/2)) oznaczono metodą real-time PCR. Zmiany w poziomie białka zostały natomiast oznaczone przy użyciu metody Western blot. Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej przy pomocy testu t-Studenta oraz jedno- lub dwuczynnikowej analizie wariancji z użyciem testu Tukeya lub Bonferroniego. Wykazano stymulacyjny wpływ BDE-47 na ekspresję białka oraz na aktywność enzymu 17β-HSD i w konsekwencji stymulację sekrecji testosteronu przez komórki pęcherzykowe. Wykazano ponadto aktywację CYP2B1/2 po 1 godz., SULT1A po 6 godz. i COMT po 24 i 48 godz. ekspozycji, co wskazuje na możliwość lokalnego metabolizmu tego związku, a tym samym możliwość działania powstających w jajniku hydroksylowanych metabolitów PBDE. Określając działania dwóch najczęściej oznaczanych w krwi ludzkiej metabolitów BDE-47, 5-OH-BDE-47 i 6-OH-BDE-47, wykazano stymulujący wpływ na sekrecję estradiolu poprzez zwiększenie ekspresji genu, białka oraz aktywności aromatazy. Tym samym wskazano odmienne w stosunku do związku wyjściowego działanie metabolitów. W dalszej części, stwierdzono brak wpływu BDE-47 i jego hydroksylowanych metabolitów na ekspresję receptora androgenowego, zarówno na poziomie genu, jak i białka. Wykazano natomiast różnice we wpływie BDE-47 i jego metabolitów na ekspresję receptorów ERα i ERβ. Odnotowano hamujący wpływ BDE-47 na ekspresję genu i białka dla ERβ i brak wpływu na ekspresję genu i białka dla ERα. Zauważono natomiast stymulację ekspresji genów i białek dla obu receptorów estrogenowych pod wpływem badanych metabolitów. Po raz pierwszy wykazano brak ekspresji genu dla receptorów CAR i PXR w kokulturach komórek pęcherzyka jajnikowego świni. Otrzymane wyniki wyraźnie wskazują na lokalny, pozawątrobowy metabolizm PBDE. Różnice w działaniu powstających metabolitów w stosunku do związku wyjściowego i ich większa aktywność biologiczna wskazują na konieczność oznaczania metabolitów ksenobiotyków przy monitorowaniu zanieczyszczenia środowiska. Ponadto, wyniki badań przeprowadzonych w ramach tej pracy doktorskiej przyczyniły się do uzupełnienia luki w wiedzy dotyczącej mechanizmu działania PBDE i ich metabolitów w jajniku na poziomie genów, białek oraz aktywności enzymów związanych z procesem steroidogenezy.

Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are flame retardants, which due to their physicochemical properties are classified as persistent organic pollutants. These compounds present high persistence in the environment and lipophilic nature and thus may pose a serious threat to human health. The European Union, the United States and China (in 2004, 2006 and 2007, respectively) have banned the production of two of the three commonly used mixtures of PBDEs, namely Penta-and Octa-BDE. Despite this fact, PBDEs are still found in all parts of the environment, including tissues derived from human. Furthermore, products in which PBDEs are intentionally used can release it into the environment, acting in a direct threat to human health due to the disrupting the hormone balance. Research conducted in the Department of Physiology and Toxicology of Reproduction of the Jagiellonian University showed that the ovary is a target tissue for polybrominated diphenyl ethers. Therefore, the aim of this doctoral dissertation was to clarify the mechanism of action of polybrominated diphenyl ethers in the ovary. The congeners selected to the study are most abundant PBDE congener found in wildlife and in humans - BDE-47 and its two hydroxylated metabolites (5-OH-BDE-47 and 6-OH-BDE-47). Model to study were ovarian follicles collected from the ovaries of sexually mature pigs. Two types of culture were carried: whole follicles and co-culture of granulosa and theca cells. The concentration of steroid hormones and the level of phase II enzymes of metabolism were determined by enzyme immunoassay (EIA) using commercial ELISA kits. To measure the activity of CYP1A1 and CYP2B1/2 fluorescence methods were used. To determine the activity of COMT and SULT1A colorimetric methods were used. Gene expression of steroidogenic pathway (HSD17B and CYP19A1), steroid hormone receptors (ESR1, ESR2 and AR) and receptors associated with the metabolism of both xenobiotics and steroid hormones (PXR and CAR (NR 1/2)) was determined by real-time PCR, whereas changes in protein level was determined using Western blot. The data were analyzed statistically by Student's t-test and one- or two-way analysis of variance with Tukey or Bonferroni test. The researches showed the stimulating effect of BDE-47 on 17β-HSD protein expression and activity and consequently the stimulation of testosterone secretion by the follicles. It was also determined that BDE-47 exposure activates CYP2B1/2 after 1 h, SULT1A after 6 h, and then COMT after 24 and 48 h of exposure, which indicates the possibility of local metabolism of the testing compound and thus possible action of locally produced hydroxylated metabolites of PBDE in ovary. Determining the action of two most abundant metabolites of the parent BDE-47 in human blood, 5-OH-BDE-47 and 6-OH-BDE-47, proved stimulating effect on the estradiol secretion by increasing the aromatase gene and protein expression and activity, thus showing differences between the activity of parent compounds and that of their metabolites. While no effect of BDE-47 and its hydroxylated metabolites has been found on the expression of the androgen receptor, either at the gene or protein level, there are significant differences in the impact of BDE-47 and its metabolites on ERα and ERβ expression. It was observed that BDE-47 has inhibitory effect on ERβ gene and protein expression and no effect on ERα, while tested metabolites have stimulating effect on gene and protein expression for both estrogen receptors. It has been showed for the first time that no gene expression for CAR and PXR in co-culture of porcine follicular cells occurs. These results clearly show the local, extrahepatic metabolism of PBDEs. Differences in the action of metabolites relative to the parent compound and its greater biological activity indicates the need for determining xenobiotic metabolites during monitoring environmental pollution. In addition, the results of studies conducted under this doctoral dissertation helped to fill the gap in knowledge on the mechanism of action of PBDEs and their metabolites in the ovary at the level of genes, proteins and enzymes associated with the process of steroidogenesis.