The effect of curcumin on germ cell vitality, divisions and death of oocytes and embryos

Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Kurkumina jest związkiem roślinnym znajdującym się w ekstrakcie z kłączy ostryżu długiego (Curcuma longa), znanym pod nazwą kurkuma. Związek ten jest składnikiem indyjskiej przyprawy curry nadającym jej żółty kolor. Kurkumina stosowana była przez tysiąclecia w tradycyjnej medycynie dalekiego wschodu jako środek antyseptyczny, wspomagający gojenie ran oraz jako lek na szereg schorzeń. W ciągu ostatnich lat kurkumina wzbudziła ogromne zainteresowanie badaczy i klinicystów jako środek o działaniu przeciwzapalnym i antyoksydacyjnym, z potencjalnym zastosowaniem w leczeniu chorób u podłoża których leży przewlekły stan zapalny, takich jak: nowotwory, choroby układu krążenia, choroba Alzheimera, reumatoidalne zapalenie stawów i cukrzyca. Pomimo niskiej bioaktywności kurkumina może także przeciwdziałać indukowanym różnymi czynnikami uszkodzeniom tkanek i narządów. Z drugiej strony wykazano, że kurkumina zarówno in vivo jak i in vitro hamuję proliferację i indukuje śmierć komórkową w różnych typach komórek nowotworowych. Kurkumina ma bardzo wiele celów molekularnych, jednakże wydaje się że jednym z ważniejszych jest czynnik transkrypcyjny NF-k B. W niniejszej rozprawie stosując metody in vitro i in vivo podjęto próbę wykazania protekcyjnego działania kurkuminy na plemniki myszy, a także pokazano jej zdolność do hamowania podziałów oocytów i preimplantacyjnych zarodków myszy. Kurkumina w stężeniu od 1 pM do 50 pM ograniczała spadek ruchliwości plemników w hodowli, bez wpływu na ich żywotność, natomiast w stężeniu 100 pM wykazywała działanie toksyczne obniżając zarówno ruchliwość jak i żywotność plemników. Kurkumina podawana doustnie wykazywała ochronne działanie na ruchliwość plemników oraz uszkodzenia kanalików plemnikotwórczych mysich samców traktowanych ftalanem - DEHP. W celu zbadania zdolności kurkuminy do hamowania podziałów prawidłowych komórek in vitro, przeprowadzono badania z wykorzystaniem mysich oocytów i dwukomórkowych zarodków, w których zgodnie z danymi literaturowymi brak jest aktywności NF-k B. Wykazano, że kurkumina w sposób zależny od dawki wpływa zarówno na podziały mejotyczne oocytów jak i podziały mitotyczne zarodków. Podawana do pożywki w stężeniu 10-30 pM hamowała wyrzucanie I ciałka kierunkowego podczas mejozy oraz mitotyczne podziały blastomerów w około połowie badanych komórek. W wyższych stężeniach, 50pM lub 100pM kurkumina, powodowała praktycznie całkowite zahamowanie podziałów mitotycznych i mejotycznych; obecność I ciałka kierunkowego oraz podział blastomerów obserwowano jedynie w pojedynczych badanych komórkach. W celu wyjaśnienie mechanizmu działania kurkuminy na podziały oocytów i zarodków sprawdzono strukturę wrzeciona podziałowego oraz poziom acetylowanej tubuliny w badanych komórkach. Wpływ kurkuminy na strukturę wrzeciona podziałowego był zależny od dawki. Kurkumina 30 pM powodowała wydłużenie mikrotubul oraz nieprawidłowości w układzie płytki metafazowej. Również w zarodkach traktowanych 30 pM kurkuminą obserwowano wydłużenie mikrotubul i nieprawidłową morfologię wrzeciona podziałowego. Zastosowanie 50 pM kurkuminy powodowało całkowitą dezorganizację wrzeciona podziałowego. Zarówno w oocytach jak i zarodkach obserwowano jedynie zagęszczenie mikrotubul dookoła skondensowanych chromosomów. Analiza metodą Western blotting oraz znakowanie immunofluorescencyjne nie wykazały znaczących różnic w poziomie acetylowanej tubuliny w oocytach i zarodkach traktowanych kurkuminą i komórkach kontrolnych, sugerując zaangażowanie innego mechanizmu w indukcję uszkodzeń wrzeciona pod wpływem kurkuminy. Ponieważ wiadomo, że surwiwina zaangażowana jest zarówno w działanie kompleksu CPC (ang. Chromosome Passenger Complex), jak i w formowanie wrzeciona podziałowego, sprawdzono jej poziom oraz lokalizację. Stosując metodę Western blotting nie wykazano zmian w poziomie surwiwiny, jednakże lokalizacja surwiwiny sprawdzana metodą immunofluorescencji wydawała się być zaburzona na skutek działania kurkuminy. Podsumowując, wyniki badań wykazały, że kurkumina może mieć działanie protekcyjne na plemniki zarówno in vitro jak in vivo, jednakże stosunkowo wysokie stężenia kurkuminy zaburzają podziały mejotyczne oocytów i mitotyczne zarodków, najprawdopodobniej na skutek zmian w wewnątrzkomórkowej lokalizacji surwiwiny.

Curcumin is the phytochemical derived from rhizome of Curcuma longa, present in the spice turmeric that gives Indian curry its yellow color. Curcumin has been used for millennia as a wound-healing agent and for treating a variety of diseases in traditional Indian and Chinese medicine. Recently, it has attracted the attention of researchers and clinicians as an anti-inflammatory and anti-oxidant agent with a potential use in therapy of many diseases with an inflammation constituents, e.g. cancer, cardiovascular disease, Alzheimer's disease, rheumatoid arthritis and metabolic syndrome. Interestingly, curcumin despite its very low bioavailability has got protective activity against many organ lesions. On the other hand, curcumin has been shown to inhibit proliferation and induce cell death in many cancer cells in vivo and in vitro. Curcumin has a myriad of molecular targets, but it is believed that the most far-reaching physiological consequences stem from its ability to inhibit transcription factor NF-κB. In this dissertation we performed experiments both in vivo and in vitro to show protective role of curcumin on mouse sperm as well as its ability to inhibit proliferation of mouse oocytes and preimplantation embryos. Accordingly, we demonstrated dose dependent effect of curcumin on sperm parameters in vitro. Curcumin used at concentration ranging from 1 μM to 50 μM reduced decrease of sperm motility in culture without influencing of their vitality, whilst 100 μM concentration of curcumin had toxic effect, demonstrating by decreasing sperm motility and vitality. We also proved the protective influence of orally administered curcumin on motility of sperm males treated with DEHP. Moreover curcumin acted against degeneration of seminiferous tubules coused by DEHP. To verify the hypothesis that curcumin can inhibit proliferation of normal cells with no active NF-кB, we performed studies on mouse oocytes and two-cell embryos undergoing meiotic and mitotic divisions, respectively. We demonstrated, that curcumin influenced meiotic divisions of mouse oocytes and mitotic divisions of early embryos in a dose dependent way. Accordingly, we showed that 10-30 μM curcumin both inhibited extrusion of I meiotic bodies and inhibition of blastomers cleavage of about half of the treated cells. The effect was more dramatic by cell treatment with 50 or 100 μM curcumin, which allowed for meiotic and mitotic divisions of a few cells and embryos, respectively. To elucidate the mechanism of curcumin's action on mice oocytes and early embryos we performed experiments on spindle formation and tubulin modification by acetylation. The severity of curcumin induced spindle abnormalities was dose-dependent. Treatment with 30 mM curcumin caused lengthening and irregularity of distribution of the spindle microtubules in MI oocytes. Moreover, the chromosomes were scattered and incorrectly aligned in treated oocytes. The treatment of two-cell embryos with 30 mM curcumin caused dramatic changes in the structure of spindle microtubules; they were long and curly, particularly at the spindle's poles. 50 mM concentration of curcumin almost completely inhibited formation of both meiotic and mitotic spindle although in oocytes and embryos the accumulation of tubulin was visible in the vicinity of condensing chromatin. Neither immunostaining nor Western blotting analysis of acetylated tubulin revealed significant differences between control and curcumintreated oocytes and embryos indicating that other mechanism(s) has to be involved in spindle deformation by curcumin. As survivin is deeply involved not only in so named chromosomal passengers complex, but also in spindle formation we checked survivin level by Western Blotting and its localization in cell treated with curcumin by immunostaining. The level of survivin was not changed, however its localization in the spindle seems to be affected by curcumin. Altogether our results showed that curcumin can have protecting effect on sperm cells in vivo and in vitro, but relatively high concentration of the compound seriously affect meiotic and mitotic divisions in vitro possibly by influencing survivin translocation to the spindle.