Somatic embryogenesis in vitro cultures of Trifolium nigrescens Viv.

Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Celem niniejszej pracy była kompleksowa analiza systemu regeneracji w kulturze zarodków zygotycznych w stadium liścieniowym Trifolium nigrescens Viv. Opracowano optymalne warunki dla indukcji somatycznej embriogenezy (bezpośredniej i pośredniej), ustalono pochodzenie i budowę zarodków somatycznych wykorzystując techniki histochemiczne i skaningowy mikroskop elektronowy (SEM), dokonano analizy immunolokalizacji wybranych epitopów pektyn (JIM5, JIM7, LM5, LM6) oraz białek arabinogalaktanowych (AGPs) (JIM4, JIM8, JIM13, JIM16, LM2, MAC207) w eksplantacie i w trakcie rozwoju zarodków somatycznych, ustalono lokalizację transkryptu genu TnSERK1 na drodze hybrydyzacji in situ oraz porównano profile białkowe eksplantatów wyjściowych z eksplantatami z kultur in vitro. Na wszystkich zastosowanych pożywkach na bazie MS z dodatkiem różnych stężeń auksyny (0,1; 0,5 lub 4 mg/l NAA) przy stałej koncentracji cytokininy (2 mg/l 2iP) uzyskano bezpośrednią somatyczną embriogenezę w rejonie hipokotyla zarodka zygotycznego, przy czym na pożywce zawierającej 0,5 mg/l NAA oraz 2 mg/l 2iP najwyższy procent eksplantatów (48%) wytwarzał zarodki somatyczne, które rozwijały się w 68% w rośliny. Stężenie stosowanej auksyny miało wpływ na czas indukcji somatycznej embriogenezy; na pożywkach o niskich stężeniach NAA (0,1 lub 0,5 mg/l) zarodki pojawiały się po 7 dniach kultury natomiast przy stężeniu wyższym (4 mg/l) po 10 dniach. W toku prowadzenia kultury obserwowano kalus, z którego również różnicowały się somatyczne zarodki. Analiza histologiczna i obserwacje w SEM wykazały, że zarodki somatyczne miały pochodzenie wielokomórkowe i większość dojrzałych zarodków somatycznych była dwubiegunowa z wyraźnie zaznaczonymi dwoma liścieniami oraz merystemem korzenia. Niektóre somatyczne zarodki w stadium torpedy oraz komórki kalusa pokrywała charakterystyczna warstwa (ECMSN, extracellular matrix surface network). Pozytywny sygnał znakowania monoklonalnymi przeciwciałami JIM5 oraz JIM7 sugeruje, że w skład ECMSN wchodziły pektyny. Rozwojowi zarodków somatycznych towarzyszyło zmniejszenie różnorodności wykrywanych epitopów białek arabinogalaktanowych; żaden z epitopów lokalizowanych w eksplantacie wyjściowym (JIM8, JIM16, LM2, MAC207) nie był obecny w dojrzałych somatycznych zarodkach. Gen TnSERK1 ulegał ekspresji w komórkach somatycznych zarodków na różnym etapie rozwoju oraz w komórkach struktur zarodkopodobnych. Transkrypt tego genu nie był obecny w komórkach nieregenerujących. Porównanie profilu białkowego eksplantatów wyjściowych, eksplantatów z zarodkami somatycznymi oraz eksplantatów tylko kalusujących pozwoliło stwierdzić, że trzy białka obecne były w większej ilości w eksplantatach z somatycznymi zarodkami. Po raz pierwszy dokonano szczegółowego porównania udziału pektyn i białek arabinogalaktanowych w ścianach komórkowych zarodków zygotycznych i zarodków somatycznych; szeroko przedyskutowano rolę ściany komórkowej i specyficznej warstwy zewnątrzkomórkowej (ECMSN) w procesie różnicowania. Opracowanie protokołu wydajnego tworzenia zarodków somatycznych u gatunku ważnego ekonomicznie ma również duże znaczenie praktyczne jako metoda mikrorozmnażania ale też dostarczająca materiału do manipulacji genetycznych.