Evaluation of extracellular neutrophil traps formation in patients with cyclic neutropenia caused by novel pathogenic variants of ELANE gene

Wrodzone neutropenie to grupa rzadkich pierwotnych niedoborów odporności, których wspólną cechą jest zmniejszenie liczby granulocytów obojętnochłonnych we krwi obwodowej poniżej normy przyjętej dla danego wieku. Ich najczęstszą przyczyną są defekty w obrębie genu ELANE, kodującego białko elastazę neutrofilową (EN). U niektórych pacjentów mutacje genu ELANE dają fenotyp w postaci cyklicznej neutropenii (ang. cyclic neutropenia, CyN), w przebiegu której obserwuje się regularne – powtarzające się klasycznie co 21 dni – epizody spadku liczby neutrofili. Białko EN jest również jednym z markerów zewnątrzkomórkowych sieci neutrofilowych (ang. neutrophil extracellular traps, NETs). NETs zbudowane są z nici DNA oraz białek histonowych i niehistonowych m.in EN. Sieci NETs stanowią swoistą barierę fizyczną, umożliwiającą złapanie, zapobieganie rozprzestrzenianiu się, unieszkodliwienie i zniszczenie dużej liczby mikroorganizmów jednocześnie. W tym kontekście, celem niniejszej pracy była ocena formowania NETs u pacjentów z CyN uwarunkowaną nowymi wariantami patogennymi w obrębie genu ELANE. Formowanie NETs oceniano metodą immunofluorescencji bezpośredniej. Dodatkowo, w supernatantach pochodzących z hodowli neutrofili pacjentów oraz zdrowych dawców krwi, oznaczono ilość wolnokrążącego DNA (ang. circulating free DNA, cfDNA) metodą fluorymetryczną. W wyniku przeprowadzonych badań, u pacjentów z CyN zaobserwowano zwiększone uwalnianie NETs, zarówno na drodze samobójczej, jak i przyżyciowej NETozy. Nie stwierdzono natomiast istotnych statystycznie różnic w poziomie cfDNA. Podsumowując, uzyskane wyniki sugerują, iż stwierdzone na poziomie molekularnym zmiany w obrębie genu ELANE mogą mieć wpływ na proces NETozy u pacjentów z CyN.

Congenital neutropenia is a rare primary immunodeficiency characterized by a reduced number of neutrophils in peripheral blood, below the appropriate age range. Defects in the ELANE gene, which encodes neutrophil elastase (NE), are the most common cause of this disease. ELANE mutations are found in some patients with cyclic neutropenia (CyN), in which episodes of neutrophil decline are observed regularly and classically repeated every 21 days. NE is also a marker for neutrophil extracellular traps (NETs). NETs are composed of DNA strands, histones, and non-histone proteins such as NE. NETs provide a specific physical barrier to catch, prevent the spread, inactivate, and destroy a large number of microorganisms simultaneously. Therefore, the aim of this study was to evaluate NETs formation in patients with CyN caused by novel pathogenic variants of ELANE gene. NETs formation was assessed by direct immunofluorescence. Circulating free DNA (cfDNA) was quantified in the supernatants of cultured neutrophils from patients and healthy blood donors using fluorimetry. As a result, increased release of NETs was observed in patients with CyN, both by suicidal and vital NETosis. There was no statistical difference in the cfDNA levels. In conclusion, our results suggest that genetic alterations may influence NETosis in patients with CyN.