Human melanoma cells xenotransplantation model using zebrafish (Danio rerio) larvae and the research of the effect of doxorubicin on tumour development

Czerniak złośliwy jest agresywnym nowotworem skóry, a jego późna diagnoza i powstanie przerzutów wiąże się z dużym ryzykiem śmierci. Czynnikami przyczyniającymi się do kancerogenezy są nadmierna ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe (UV), co prowadzi do powstania mutacji w DNA melanocytów tj. komórek skóry odpowiedzialnych za produkcję melaniny. Transformacja nowotworowa w melanocytach zajść może w ciągu kilku miesięcy. Organizmem modelowym, dzięki któremu można badać komórki nowotworowe i ich reakcję na chemioterapeutyki, może być danio pręgowany (Danio rerio). Larwy danio nie posiadają odporności nabytej, co umożliwia ksenotransplantację ludzkich komórek nowotworowych do organizmu larwy bez ich odrzucenia. Co więcej, dzięki przezroczystemu ciału, możliwe jest przyżyciowe obrazowanie larw i obserwacja komórek nowotworowych. Testowane w badaniach leki mogą zostać podane larwom poprzez immersję, czyli bezpośrednio do środowiska wodnego, w którym utrzymywane są larwy danio. Celem niniejszej pracy było opracowanie modelu ksenotransplantacji ludzkich komórek czerniaka do żółtka larw danio pręgowanego oraz zbadanie wpływu doksorubicyny (DOX), często używanego leku przeciwnowotworowego o właściwościach cytostatycznych, na komórki czerniaka po ksenotransplantacji do larw danio. Badania rozpoczęto od eksperymentów in vitro, w których wykazano, że ludzkie komórki czerniaka nie obumierają w temperaturze 32 °C, dzięki czemu możliwa jest ich mikroiniekcja do danio i późniejsza inkubacja larw w temperaturze niższej niż 37 °C. W kolejnym etapie badań zoptymalizowano technikę mikroiniekcji ludzkich komórek nowotworowych do żółtka larw danio pręgowanego w drugim dniu po zapłodnieniu. Określono również bezpieczną dla larw danio dawkę doksorubicyny (10 mg/L). W ostatnim etapie eksperymentów zbadano wpływ doksorubicyny na komórki ludzkiego czerniaka linii 1205Lu, które zostały podane do żółtka larw danio pręgowanego dwa dni po zapłodnieniu. Komórki wcześniej wybarwiono barwnikiem fluorescencyjnym, dzięki czemu możliwe było ich obrazowanie w mikroskopie fluorescencyjnym. Larwy obserwowano z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego godzinę po iniekcji oraz w 1, 2 i 3 dniu po podaniu DOX. Badanymi czynnikami były pole powierzchni oraz kolistość skupisk utworzonych przez komórki nowotworowe. W przeprowadzonych badaniach nie wykazano wpływu doksorubicyny na pole powierzchni i kolistość skupisk komórek czerniaka. Opracowany model ksenotransplantacji komórek czerniaka do larw danio może służyć do badania efektu działania innych leków przeciwnowotworowych.

Malignant melanoma is an aggressive skin cancer and its late diagnosis and metastasis frequently leads to death. Responsible for cancerogenesis are excessive UV irradiation, which may induce DNA mutations in melanocytes, the melanin-producing cells found in the skin. They can change from regular into cancerous cells in a matter of months. Zebrafish (Danio rerio) larvae can be used as a laboratory model organism to study cancer cells and their response to different chemotherapeutics. Zebrafish larvae don't have an adaptive immunity, so human cancer cells are not rejected after xenotransplantation. The larvae are transparent making possible imaging of tumor development in vivo. Finally, the therapeutic agents can be easily administered into zebrafish larvae through immersion. The main aim of this work was to establish a model of xenotransplantation of human melanoma cells to the yolk of zebrafish larvae and to study the effect of doxorubicin (DOX), a well-known therapeutic with cytostatic activity, on human melanoma cells using zebrafish larvae model. In vitro experiments proved that human melanoma cells can be incubated at 32 °C, which allowed us to perform microinjection of melanoma cells into yolk of zebrafish larvae, which are normally kept in temperature lower than 37 °C. To do this, first, microinjection of melanoma cells into the zebrafish yolk at two days post fertilization (dpf) was optimised. In order to study the effect of doxorubicin on melanoma cells xenotransplants in zebrafish larvae, the safe dose of DOX was chosen as 10 mg/L based on the toxicity test. Finally, to study the effect of DOX on human melanoma cells, zebrafish larvae (AB-TL line) were injected into the yolk with 1205Lu cells at 2 dpf. Cells were stained with fluorescent dye, making them detectable using fluorescence microscopy. DOX (10 mg/L) was administered via water (changed daily). Larvae were imaged at 1 hour and 1, 2, and 3 days post DOX administration. The tumor surface area and its circularity were calculated. Our results demonstrated that there were no statistically significant differences in the surface area and circularity of tumors between DOX-treated and control larvae. The optimisation of melanoma cell microinjection into yolk of zebrafish larvae allow us to study the effect of other melanoma-specific drug using zebrafish model in the future.