Impact of sodium butyrate on the expression of inducible nitric oxide synthase and nitrites by lipopolysaccharide-activated macrophages

Makrofagi to jedne z najważniejszych leukocytów biorących udział w reakcjach zapalnych organizmu, ze względu na ich dużą plastyczność fenotypową i wydłużoną obecność w miejscu zapalenia w porównaniu do neutrofili. Pod wpływem czynników zapalnych makrofagi różnicują się w fenotyp prozapalny (M1), co skutkuje wydzielaniem, między innymi, tlenku azotu (NO) o właściwościach bakteriobójczych. Indukowalna syntaza tlenku azotu (iNOS) jest odpowiedzialna za produkcję NO z argininy w odpowiedzi na cytokiny zapalne i produkty drobnoustrojowe. Ostatnie badania donoszą, że krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe wykazują potencjał terapeutyczny w leczeniu przewlekłych stanów zapalnych. W szczególności maślan sodu wydaje się mieć silne działanie przeciwzapalne poprzez hamowanie wydzielania cytokin zapalnych przez makrofagi M1. Dlatego tego celem niniejszej pracy było zbadanie wpływ maślanu sodu na makrofagi linii RAW 264.7 Testowano 3 stężenia tego związku, kolejno: 0,02 mM, 0,5 mM, 10 mM. Badano żywotność i aktywność metaboliczną makrofagów oraz zdolność do przeprowadzania reakcji oksydoredukcyjnych przez te komórki. Ponadto weryfikowano ekspresję iNOS oraz produkcję azotynów przez makrofagi linii komórkowej RAW 264.7 aktywowane lipopolisacharydem (LPS). Nasze badania wykazały, że maślan sodu w stężeniu 10 mM ma działanie cytotoksyczne, przy czym żywotność zbadano dwoma metodami – testem Presto Blue i testem CV. Zaobserwowano również spadek aktywności mitochondrialnej makrofagów po stymulacji maślanem sodu niezależnie od wcześniejszej stymulacji LPS.W pracy pokazano dawko-zależny spadek produkcji NO i ekspresji indukowalnej syntazy tlenku azotu w obecności maślanu. Wydaje się, że maślan sodu o stężeniu 0,5 mM wykazuje największy potencjał terapeutyczny, ponieważ makrofagi traktowane związkiem o tym stężeniu wykazywały znacznie zmniejszoną ekspresję iNOS i spadek w produkcji tlenku azotu, przy czym nie zaobserwowano spadku żywotności makrofagów. W literaturze można znaleźć wiele doniesień o przeciwzapalnych właściwościach krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, lecz to maślan sodu wydaje się mieć najsilniejsze właściwości modulujące odpowiedź immunologiczną organizmu. Literatura oraz otrzymane wyniki sugerują potrzebę kontynuacji badań nad wpływem maślanu sodu na immunologiczne parametry makrofagów, w tym na modelu in vivo.

Macrophages are one of the most important leukocytes involved in the inflammatory response due to their high phenotypic plasticity and prolonged presence at the inflammatory ofucs in comparition to neutrophils. In presence of inflammatory factors, macrophages differentiate into a pro-inflammatory phenotype (M1) which secrets, among others, nitric oxide (NO) with bactericidal properties. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) is responsible for the production of NO from arginine in response to inflammatory cytokines and microbial products.Recent studies report that short-chain fatty acids have therapeutic potential in the treatment of chronic inflammation. Specifically, sodium butyrate appears to have potent anti-inflammatory effects by inhibiting the secretion of inflammatory cytokines by M1 macrophages. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of sodium butyrate on macrophages of the RAW 264.7 cell line. Three concentrations of this compound were tested, 0.02 mM, 0.5 mM, 10 mM, respectively. The viability and metabolic activity of macrophages as well as the ability to carry out redox reactions were studied. In addition, the expression of iNOS and the production of nitrites by RAW 264.7 macrophages activated with lipopolysaccharide (LPS) were verified. Our studies have shown that sodium butyrate at a concentration of 10 mM has a cytotoxic effect when tested by two methods - the Presto Blue test and the CV test. A decrease in macrophage mitochondrial activity was also observed after sodium butyrate stimulation regardless of prior LPS stimulation.The thesis shows a dose-dependent decrease in NO production and expression of inducible nitric oxide synthase in presence of butyrate, and 0.5 mM sodium butyrate appears to have the greatest therapeutic potential as macrophages treated with this concentration showed significantly reduced iNOS expression and a decrease in nitric oxide production with no effect on cell viability. There are numerous reports on the anti-inflammatory properties of short-chain fatty acids, but sodium butyrate seems to have the strongest properties that modulate the immune response. Literature and obtained data suggest the studies on sodium butyrate impact on immunological parameters of macrophages should be continued, including in vivo models.