Production of murine monoclonal antibodies specific to CDKF1 protein from Arabidopsis thaliana using Hybridoma Technology

Białko CDKF1 (kinaza cyklinozależna F1) pełni istotną rolę w regulacji zarówno cyklu komórkowego jak i procesu translacji. Dokładna funkcja oraz struktura tej kinazy w roślinach nie jest do końca poznana, dlatego istnieje potrzeba wyprodukowania przeciwciał, które będą użyteczne w określeniu struktury tej kinazy przy użyciu mikroskopii krio-EM (kriomikroskopia elektronowa) z wykorzystaniem siatek powinowactwa. Z myszy szczepu BALB/c, po udanej immunizacji fragmentem białka CDKF1 (wersja skrócona do 445 aminokwasów) wyizolowano splenocyty, które następnie unieśmiertelniono wykorzystując w tym celu fuzję z komórkami szpiczaka SP2/0 przy użyciu glikolu polietylenowego. Uzyskane klony komórek hybrydoma weryfikowano pod kątem produkcji przeciwciał specyficznych względem CDKF1 (wersji skróconej do 445 aminokwasów). Wyprodukowano i scharakteryzowano ostatecznie dwa klony komórek hybrydoma produkujące dwa różne przeciwciała monoklonalne: 2F2C11B8, 3F9E11E10. Potwierdzono wiązanie wyprodukowanych przeciwciał do pełnej wersji białka CDKF1. Użyteczność przeciwciał pod kątem zastosowania w mikroskopii krio-EM w celu określenia struktury białka CDKF1 jest weryfikowana w prowadzonych aktualnie badaniach.

The CDKF1 protein (Cyclin-Dependent Kinase F1) plays a significant role in regulating the cell cycle and the translation process. The exact function and structure of this kinase in plants are not fully understood. Therefore, there is a need to produce antibodies that will be useful in determining the structure of this kinase using cryo-electron microscopy (cryo-EM) with affinity grids. Splenocytes were isolated from BALB/c mice after successful immunization with a fragment of the CDKF1 protein (shortened version of 445 amino acids). These splenocytes were then immortalized through fusion with SP2/0 myeloma cells using polyethylene glycol. The resulting hybridoma cell clones were screened for the production of antibodies specific to the shortened version of CDKF1 (445 amino acids). Two hybridoma cell clones were produced and characterized, producing two monoclonal antibodies: 2F2C11B8 and 3F9E11E10. The binding of the produced antibodies to the full-length CDKF1 protein was confirmed. The utility of these antibodies for use in cryo-EM microscopy to determine the structure of the CDKF1 protein is currently being verified in ongoing research.