Optimization of trans-resveratrol determinations in biological material by UHPLC-MS/MS method

Celem niniejszej pracy była optymalizacja metody oznaczania aktywnego biologicznie związku obecnego m.in w czerwonym winie trans–rezweratrolu w materiale biologicznym przy użyciu wysokiej klasy chromatografu cieczowego sprzężonego ze spektrometrem masowym UPLC-MS/MS firmy Waters Corp., USA. Na pierwszym etapie prowadzono próby celem wyboru najlepszego typu jonizacji. Ostatecznie zdecydowano się na technikę elektrorozpylania (ESI) w trybie jonizacji ujemnej dla oznaczanego trans–rezweratrolu oraz w trybie jonizacji dodatniej dla wzorca wewnętrznego (IS) przyjętego w trakcie oznaczeń – karbamazepiny. Następny krok analizy polegał na ustaleniu, który z dwóch wytypowanych rozpuszczalników, a mianowicie acetonitryl czy metanol okaże się bardziej odpowiedni dla badanego analitu. W toku badań lepszą jakością sygnału oraz jego intensywnością na widmie MRM odznaczał się acetonitryl. Jako metodę wyosabniania związku z materiału biologicznego zastosowano metodę precypitacyjną przy użyciu acetonitrylu nie zaś ekstrakcję z zastosowaniem octanu etylu jako ekstrahenta. Analiza chromatograficzna została przeprowadzona z użyciem 1% octanu amonu w wodzie oraz acetonitrylu jako fazy ruchomej. Rozdział chromatograficzny przebiegał przy użyciu kolumny ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 um, 2.1 x 50 mm, Waters, USA). Oznaczony średni czas retencji dla trans–rezweratrolu wynosił 1,73 min natomiast dla wzorca wewnętrznego –karbamazepiny 1,92 min. Krzywa kalibracyjna wyznaczona w trakcie analizy dla trans-rezweratrolu znajdującym się w próbkach sporządzonych z homogenatu wątroby szczura charakteryzowała się współczynnikiem determinacji – R2 wynoszącym 0.997084. Badana metoda oznaczeń dla trans-rezweratrolu odznaczała się liniowością w przedziale 10 – 1000 µg/ml

The aim of this study was to optimize the method of determining the popular current compound occurring in red wine trans-resveratrol in biological material using a high-class liquid chromatograph coupled with a UPLC-MS/MS mass spectrometer from Waters Corp., USA. At the first stage, attempts were made to select the best type of ionization. Finally, it was decided to use the electrospray technique (ESI) in the negative ionization mode for the determined trans-resveratrol and in the positive ionization mode for the internal standard (IS) adopted during the tests - carbamazepine. The next step in the analysis was to determine which of the two selected solvents, namely acetonitrile or methanol, turned out to be more suitable for the tested analyte. In the course of the research, acetonitrile showed a better quality of the signal and its intensity in the MRM spectrum. As a method for isolating a compound from biological material, the precipitation method using acetonitrile was used, and not extraction using ethyl acetate as the extractant. Chromatographic analysis was performed using 1% ammonium acetate in water with acetonitrile as the mobile phase. The chromatographic separation was carried out using an ACQUITY UPLC BEH C18 column (1.7 µm, 2.1 x 50 mm, Waters, USA). The mean retention time for trans-resveratrol was 1.73 min, while for the internal standard - carbamazepine - 1.92 min. The calibration curve determined during the analysis for the trans-resveratrol present in the samples prepared from the rat liver homogenate was characterized by the coefficient of determination - R2 equal to 0.997084. The tested method of determinations for trans-resveratrol was characterized by linearity in the range of 10 - 1000 µg/ml.