Dephosphorylation of plant kinases involved in the cell cycle and their stability and biochemical properties on the example of CDKF;1 protein from Arabidopsis thaliana

Aktywacja podziału komórek i przejścia między różnymi fazami cyklu komórkowego są kontrolowane przez rodzinę zależnych od cyklin kinaz białkowych Ser/Thr (CDK). U roślin zidentyfikowano 7 różnych typów CDK (A-G), spośród których wyróżniano 2 typy CDK -CDKD oraz CDKF, które należą do kinaz aktywujących inne CDK (CAK). Do klasy CDKF należy tylko jedna kinaza białkowa zależa od cyklin – CDKF;1. Uczestniczy ona w regulacji podziału komórek u Arabidopsis thaliana i wpływa na kontrolę procesu transkrypcji i rozwój postembrionalny roślin. Celem pracy jest analiza wpływu defosforylacji białka CDKF;1 na wydajność jego produkcji w bakteryjnym systemie ekspresyjnym oraz oczyszczania przy użyciu chromatografii powinowactwa. W celu nadprodukcji białka użyto plazmid z wklonowaną skróconą sekwencją genu białka CDKF;1 oraz komórki kompetentne E.coli NiСo21 i E.coli NiСo 21 z indukowaną ekspresją fosfatazy λ. Następnie białko CDKF;1 izolowano i oczyszczano za pomocą chromatografii powinowactwa IMAC. Otrzymane frakcje po elucji analizowano metodą SDS-PAGE, a wydajność procesu oczyszczania oceniano na podstawie pomiaru stężenia białka.

The activation of cell division and transitions between the different phases of the cell cycle are controlled by the family of cyclin-dependent Ser / Thr protein kinases (CDKs). In plants have been identified 7 different types of CDK (A-G). Of which two types of CDKs, CDKD and CDKF, which belong to the kinases activating other CDKs (CAKs), were distinguished. Only one cyclin dependent protein kinase belongs to the CDKF class - CDKF; 1. This protein kinase is involved in the regulation of cell division in Arabidopsis thaliana and influences the control of the transcription process and post-embryonic development of plants. The purpose of this experiment is analyze the effect of CDKF;1 protein dephosphorylation on the efficiency of its production in a bacterial expression system and purification using affinity chromatography. For this purpose was used a plasmid with a truncated CDKF;1 protein construct, were transformed the competent cells of E.coli NiСo21 and E.coli NiСo 21 with induced expression of λ phosphatase with the plasmid and was induced overexpression. Then the CDKF;1 protein was isolated and purified by EMIC affinity chromatography. The obtained elution fractions were analyzed by SDS-PAGE. After confirming the content of CDKF;1 protein in the isolated fractions, after the analysis of electrophoretic images, using the Bradford method performed measurement protein concentration.