Badanie biochemicznej aktywności ludzkiego kompleksu Elongatora

Translacja jest kluczowym etapem w procesie ekspresji genów, który opiera się na dokładności z jaką rybosomy odczytującą informacje zawarte w mRNA. W celu utrzymania wierności translacji, niektóre tRNA podlegają modyfikacjom, co zapobiega ewentualnemu niedopasowaniu kodonów. Jednym z enzymów modyfikujących tRNA jest kompleks Elongatora. Składa się on z sześciu różnych podjednostek (Elp1-6), występujących w dwóch kopiach. Główną funkcją Elongatora jest modyfikacja urydyny (U34) znajdującej się na tzw. chwiejnej pozycji w tRNA, mającym na celu utrzymanie stabilności translacji. Co więcej, wykazano, że mutacje punktowe w obrębie kompleksu są powiązanie ze schorzeniami, takimi jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne, co podkreśla znaczenie kompleksu Elongatora w medycynie.Wszystkie sześć podjednostek ma znaczenie w utrzymaniu stabilności kompleksu, lecz jedynie Elp3 ma zdolność do wiązania i modyfikacji antykodonu tRNA. Poprzednie badania na kompleksem Elongatora zostały przeprowadzone na prokariotach i drożdżach, jednak posiadając odpowiednie konstrukty, możemy po raz pierwszy odtworzyć te badania na ludzkim kompleksie. Pierwszym celem tego projektu było wprowadzenie mutacji mających wpływ na wiązania tRNA, a następnie przeprowadzenie analizy biochemicznej aktywności subkompleksu Elp123, a następnie planowano stworzenie wektorów, które umożliwiłyby ekspresję pełnego kompleksu Elongatora w komórkach owadzich.W ramach wyników, udało nam się stworzyć nowy konstrukt dla ko-ekspresji podjednostek Elp4, Elp5 i Elp6 w owadzich komórkach, a także zoptymalizowaliśmy protokoły ukierunkowanej mutagenezy i oczyszczania subkompleksu Elp123. Pomimo, braku możliwości ukończenia i ekspresji wszystkich przewidzianych mutantów, mających wpływ na wiązanie tRNA, udało nam się uzyskać wstępne wyniki dotyczące wiązania tRNA przez dziki typ subkompleksu Elp 123, a także jego mutantów odpowiadających za procesy nowotworzenia i choroby neurodegeneracyjne.Praca nad tym projektem przyczyniła się do stworzenia i optymalizacji protokołów, od etapów klonowania, po proces oczyszczania ludzkiego subkompleksu Elongatora.

Translation is a crucial process during gene expression that relies heavily on the accuracy of the ribosomes decoding messenger RNAs (mRNAs). To maintain precise codon recognition, some transfer RNAs (tRNAs) involved in the translation get modified, preventing possible codon mismatch. One of the post-transcriptional modifiers is the Elongator complex. The Elongator complex consists of two sets of six individual subunits (Elp1-6). Its primary function is to modify the uridine base in the wobble position of the tRNA anticodon (U34) to maintain translation accuracy. Moreover, the discovery of numerous diseases like cancers and neurodegenerations associated with point mutations in the complex underlines the clinical importance of Elongator.All six subunits have equal importance in maintaining the complex integrity. However, only Elp3 has the ability to bind and modify the tRNA anticodon. Previous studies were based on procaryotes or yeast, yet in this project's scope, we work on the human complex for the first time. The first objective of this project was to create tRNA binding mutants and then biochemically characterize their tRNA binding properties and activity as well as construct plasmids for the expression of the full complex in insect cells. As a result, we successfully created the plasmid for the co-expression of subunits Elp4, Elp5 and Elp6 in insect cells using Gibson assembly. We also optimized site-directed mutagenesis and purification protocols to study the tRNA binding mutants of the Elp123 subcomplex. While unsuccessful in creating and expressing all the envisioned tRNA binding mutants, we still obtained some preliminary data on tRNA binding for the WT subcomplex and mutants accountable for cancer and neurodegeneration diseases. The results from this master thesis helped setting up the human Elongator project, including protocols from cloning till protein purification.