The effect of visfatin on expression of selected cell cycle proteins of human placental line JEG-3

Prawidłowy rozwój i funkcjonowanie łożyska są niezbędnymi czynnikami do pomyślnego przebiegu ciąży. Na funkcjonowanie łożyska ma wpływ wiele cząsteczek sygnałowych, w tym substancje wytwarzane przez tkankę tłuszczową zwane adipokinami. Wśród adipokin zbadano rolę leptyny, apeliny i adiponektyny w implantacji i rozwoju łożyska. Wisfatyna jest kolejną adipokiną nie tylko syntetyzowaną w łożysku, ale także mającą wpływ na działanie tego narządu. Do głównych funkcji wisfatyny w organizmie należy regulacja wydatku energetycznego, metabolizmu tłuszczów i węglowodanów oraz apetytu. W badaniach prowadzonych m.in na komórkach raka piersi oraz komórkach raka wątroby wykazano, że wisfatyna może również wpływać na proliferację i cykl komórkowy, poprzez regulację ekspresji białek związanych z tymi procesami. Jak dotąd nie ma jednak badań na temat bezpośredniego działania wisfatyny na cykl komórkowy komórek łożyska ludzkiego. Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu wisfatyny na poziom białek cyklu komórkowego w komórkach linii łożyska ludzkiego JEG-3. Za regulację cyklu komórkowego w komórkach ssaków odpowiedzialne są białka zwane cyklinami, które wiążą się z kinazami cyklinozależnymi (CDK) i aktywują je. Do grupy cyklin należą cykliny D, E, A, B, które w parze z danym CDK odpowiedzialne są za progresję oraz przejścia między określonymi fazami cyklu. Istotnym białkiem w cyklu komórkowym jest także antygen jądrowy komórek proliferujących (PCNA), który wchodzi w interakcje z białkami zaangażowanymi w regulację cyklu komórkowego oraz odpowiada za syntezę, naprawę i rekombinację DNA. W niniejszym badaniu modelem doświadczalnym były komórki linii JEG-3 odpowiadające komórkom cytotrofoblastu pozakosmkowego. Hodowlę in vitro komórek łożyska prowadzono w medium DMEM F12 z 1% FBS z dodatkiem wisfatyny w stężeniu 10 ng/ml przez 48 i 72 godziny. Do zbadania ekspresji białek użyto metody Western blot, natomiast ekspresję genów zmierzono metodą real time - PCR. Analizę statystyczną wykonano w programie GraphPad Prism 8 wykorzystując testy ANOVA i Tukeya. Analiza Western blot wskazuje, że wisfatyna zmniejsza ekspresję cyklin D, A, B po 48 i 72 godzinach inkubacji, a cykliny E oraz markera proliferacji PCNA po 72 godzinach. Dodatkowo wykazano hamujący wpływ wisfatyny na poziom genu cyklin D, E, B po 48 i 72 godzinach, a w przypadku PCNA tylko po 72 godzinach. Podsumowując, uzyskane wyniki wykazały, że wisfatyna w linii łożyska ludzkiego JEG-3 wpływa na ekspresję białek cyklu komórkowego zmniejszając ich ekspresję zarówno na poziomie genu i białka. Powyższe wyniki badań wskazują, że wisfatyna, podobnie jak apelina jest kolejną adipokiną regulującą różnicowanie i rozwój łożyska.

Proper placental development and functioning are essential factors for a successful pregnancy. The function of the placenta is affected by many signaling molecules, including substances produced by adipose tissue called adipokines. Among adipokines, the role of leptin, apelin, and adiponectin in placental implantation and development have already been studied. Visfatin is another adipokine not only synthesized in the placenta but also involved in the functioning of this organ. The main roles of visfatin in the organism include regulation of energy expenditure, fat and carbohydrate metabolism, and appetite. In studies conducted on breast cancer cells and liver cancer cells, among others, it has been shown that visfatin can also affect cell proliferation and cell cycle by regulating the expression of proteins related to these processes. However, there is no research on the direct effects of visfatin on the cell cycle of human placental cells. The aim of the present study was to investigate the effect of visfatin on the levels of cell cycle proteins in cells of the human placental line JEG-3. The regulation of the cell cycle in mammalian cells is mediated by proteins called cyclins, which bind to and activate cyclin-dependent kinases (CDKs). The class of cyclins includes cyclins D, E, A, B, which when paired with a particular CDK are responsible for progression and transitions between specific phases of the cycle. An important protein in the cell cycle is also the proliferating cell nuclear antigen (PCNA), which interacts with proteins involved in cell cycle regulation and is responsible for DNA synthesis, repair and recombination. In this study, the JEG-3 lineage cells corresponding to extraembryonic cytotrophoblast cells are the experimental model. In vitro culture of placental cells was conducted in DMEM F12 medium with 1% FBS supplemented with visfatin at a concentration of 10 ng/ml for 48 and 72 hours. Western blot was used to examine protein expression, gene expression was measured by real time - PCR. Statistical analysis was performed in GraphPad Prism 8 software using ANOVA and Tukey's tests. Western blot analysis indicates that visfatin decreases the expression of cyclins D, A, B after 48 and 72 hours of incubation, and decreases the expression of cyclin E and the proliferation marker PCNA after 72 hours. In addition, the inhibitory effect of visfatin on mRNA levels of cyclins D, E, B after 48 and 72 hours, and for PCNA only after 72 hours, was demonstrated. In conclusion, the results showed that visfatin in the human placental line JEG-3 affects the expression of cell cycle proteins by reducing their expression at both gene and protein levels. The results presented above indicate that visfatin, like apelin, is another adipokine that regulates placental differentiation and development.