The effect of changes of protonable amino acid residues within the ubiquinone reducing catalytic site (Qi site) on enzymatic activity and properties of bacterial cytochrome bc1

Cytochrom bc1 jest kluczowym białkiem uczestniczącym w przemianach bioenergetycznych wielu organizmów. Jego mechanizm opiera się na zmodyfikowanym cyklu Q, podczas którego następuje utlenienie dwóch cząsteczek ubichinolu w centrum katalitycznym Qo i redukcja jednej cząsteczki ubichinonu w centrum katalityczym Qi, co jest sprzężone z transportem protonów w poprzek błony, przyczyniającym się do generacji siły protonomotorycznej. Redukcja ubichinonu w centrum Qi wiąże się z transferem protonów z zewnątrz do centrum, który pomimo wielu lat badań nie jest jeszcze w pełni scharakteryzowany. Wśród aminokwasów znajdujących się w kieszeni wiążącej ubichinon zidentyfikowano kilka kluczowych reszt aminokwasowych w tym His217, Lys251 i Asp252, które mogą brać bezpośredni udział w transferze protonów (numeracja dla organizmu modelowego Rhodobacter capsulatus). Postuluje się istnienie dwóch głównych ścieżek transferu protonów na ubichinon - ścieżki D252/K251 (od strony grupy karbonylowej C1 ubichinonu) i H217 (od strony grupy karbonylowej C4 ubichinonu). Celem tej pracy jest charakterystyka pod względem strukturalnym, funkcjonalnym i kinetycznym podwójnej muteiny cytochromu bc1 D252N/H217R. W związku z tym wykonano analizę składu podjednostkowego i widm absorpcyjnych enzymu, pomiary kinetyczne z zastosowaniem metod spektroskopowych oraz wzrosty fotosyntetyczne. Mutacja D252N/H217 spowalnia działanie całego enzymu i ma charakter letalny, lecz nie blokuje wprost transferu protonów na ubichinon w centrum katalitycznym Qi. Wyniki sugerują mniejszą stabilność ubichinonu w centrum Qi. Spadek stabilności oraz utrata części dróg protonacji prawdopodobnie odpowiadają za letalny efekt mutacji. Ponadto, wyniki potwierdzają istnienie alternatywnych dróg protonacji, lecz także sugerują, że przynajmniej jedna ścieżka musi być w pełni funkcjonalna aby podtrzymać wzrost komórek.

Cytochrome bc1 is a key protein participating in energy conversion in biological membranes of many organisms. Its mechanism is based on a modified Q cycle, during which two ubiquinol particles are oxidised in the Qo site and one ubiquinone particle is reduced in the Qi site. It is coupled with a proton transport across a membrane which contribute to a proton-motive force generation. In the Qi site, a reduction of an ubiquinol occurs, requiring a transfer of two electrons and two protons. Proton transfer pathways of the Qi site have not been yet well characterised. Among amino acids located in the Qi binding pocket, some important residues were identified, including His217, Lys251 and Asp252, which can directly participate in a proton transfer (numbering for model organisms Rhodobacter capsulatus). An existence of two main protonation pathways, containing the above residues, is posited – D252/K251 pathway (to ubiquinone’s carbonyl group C1) and H217 pathway (to ubiquinone’s carbonyl group C4). The aim of this thesis is a structural, functional and kinetic characterisation of cytochrome bc1 double mutein D252N/H217R. For this purpose, a subunit composition and absorption spectra analysis, spectroscopic, kinetic measurements and photosynthetic growths were conducted. D252N/H217R double mutation hampers an enzyme activity and is lethal, but doesn’t block the proton transfer from outside to the Qi site. Results suggest a decrease in ubiquinone stability in the Qi site. The stability decrease and loss of some protonation pathways are probably reasons for a lethal effect. Furthermore, results confirm an existence of alternative protonation pathways, but also suggest that at least one pathway must be fully functional to maintain functionality of a cell.