Expression and purification of the improved Pfu polymerase variants and comparison of their activities depending on the composition of the amino acid linker.

Jednym ze stosowanych podejść do zwiększenia wydajności polimeraz jest stworzenie białek fuzyjnych. W przypadku termostabilnej polimerazy Pfu do jej C-końca dołączono białko Sso7d, pochodzące z hipertermofilnego archeona Sulfolobus acidocaldarius, uzyskując tzw. polimerazę Phusion. Białko Sso7d wiąże niespecyficzne sekwencje dsDNA, stabilizując wiązanie polimeraza-DNA, zwiększając jej procesywność, ale także wierność sekwencji i umożliwiając syntezę nici komplementarnych na matrycach bogatych w trudnotopliwe pary GC. Celem tej pracy było stworzenie trzech plazmidów, zawierających geny polimerazy Pfu połączonej z genem białka Sso7d za pomocą trzech różnych łączników aminokwasowych – sztywnego RPR i elastycznych GSG i GTH. Po ekspresji białek w szczepie E.coli Bl21pLysS przeprowadzono dwa testy aktywności. Zbadano aktywność uzyskanych polimeraz fuzyjnych PHU dla pięciu stężeń jonów magnezu oraz sprawdzono stabilność polimeraz po poddaniu ich wstępnej denaturacji w 98°C w pięciu punktach czasowych.

One of the approaches used to increase efficiency of polymerases is the preparation of fusion proteins. In case of the thermostable Pfu polymerase, the Sso7d protein from the hyperthermophilic archaea Sulfolobus acidocaldarius was attached to its C-terminus, resulting in the so-called Phusion polymerase. The Sso7d protein binds non-specificly dsDNA sequences, stabilizing the polymerase-DNA interaction, increasing its processivity also sequence fidelity and enabling the synthesis of complementary strands on templates rich in refractory GC pairs. In this work, three plasmids where created. Plasmids containing Pfu polymerase genes linked to Sso7d protein gene by three different aminoacid linkers – rigid RPR linker and flexible GSG and GTH linkers. Proteins were expressed in E. coli BlpLysS strain and later two activity tests were performed. We tested the activity of PHU fusion polymerases in five concentrations of magnesium ions and the stability of polymerases after initial denaturation at 98°C in five time points.