Epigenetic conversion of granulosa cells isolated from porcine follicles into cells of the nervous system

Jajnik ssaka to parzysta gonada, w której można wyróżnić rdzeń i korę jajnika. W rdzeniu znajdują się naczynia krwionośne i limfatyczne, natomiast w korze - pęcherzyki jajnikowe na różnych etapach rozwoju. Jednym z podstawowych elementów składowych pęcherzyków jajnikowych są komórki ziarniste. Stanowią one populację komórek, która oprócz tego, że jest odpowiedzialna za syntezę hormonów steroidowych, warunkuje także prawidłowy rozwój i dojrzewanie oocytu.W prezentowanej pracy, komórki ziarniste wyizolowane z niedojrzałych pęcherzyków jajnikowych świń (ø 4 – 6 mm), poddano 96-godzinnej hodowli wstępnej. Po tym czasie, komórki z hodowli eksperymentalnej tzw. odróżnicowującej, inkubowano przez 18 godzin z modyfikatorem epigenetycznym – 5-Azacytydyną (10 µM/105 komórek). Po zakończeniu hodowli część komórek zebrano i poddano analizie immunofluorescencyjnej oraz analizie Western blot, celem potwierdzenia obecności białkowych markerów charakterystycznych dla pluripotencjalnych komórek macierzystych: Oct-4, Sox2 i c-Kit. Następnie, uzyskane komórki podobne do pluripotencjalnych komórek macierzystych (cells like-pluripotent Stem Cells, cl-pSCs) poddano różnicowaniu w kierunku komórek układu nerwowego. W tym celu cl-pSCs poddano 14-dniowej hodowli in vitro w obecności forskoliny i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (basic Fibroblast Growth Factor, bFGF). Po zakończeniu hodowli różnicującej, komórki poddano analizie immunofluorescencyjnej na obecność wybranych markerów komórek układu nerwowego: NeuN, NPY oraz GFAP. Uzyskane w trakcie hodowli komórek ziarnistych w obecności modyfikatora epigenetycznego – 5-Azacytydyny, wyniki potwierdziły, że komórki ziarniste zostały odróżnicowane do komórek wykazujących cechy pluripotencjalnych komórek macierzystych. Świadczy o tym obecność wybranych markerów białkowych: Oct-4, Sox2 i c-Kit, a także zdolność do różnicowania w komórki układu nerwowego. Potwierdzona obecność białek NeuN i NPY dowodzi, że cl-pSCs uległy różnicowaniu w kierunku neuronów, natomiast ekspresja GFAP świadczy o tym, że komórki te uległy różnicowaniu w astrocyty. Podsumowując, otrzymane wyniki wskazują, że manipulacje epigenetyczne z wykorzystaniem 5-Azacytydyny mogą stanowić wydajną, alternatywną metodę przeprogramowania komórek. Dzięki wykorzystaniu 5-Azacytydyny udało się z komórek ziarnistych pęcherzyka jajnikowego świni uzyskać komórki podobne do pluripotencjalnych komórek macierzystych, które następnie z powodzeniem poddano różnicowaniu w komórki układu nerwowego. Może się to przyczynić do zmiany podejścia do manipulacji epigenetycznych w zakresie medycyny regeneracyjnej.

The mammalian ovary is a paired gonad where cortex and medulla can be discerned. In the medulla there are blood and lymphatic vessels while in the cortex ovarian follicles at various stages of differentiation reside. One of basic constituents of ovarian follicles are granulosa cells. They form a population of cells that apart from being responsible for steroid hormone synthesis also drive proper development and maturation of the oocyte. In the presented paper granulosa cells isolated from immature porcine ovarian follicles (ø 4 – 6 mm) were initially cultured for 96 hours. After that, cells from the experimental culture, de-differentiating one were incubated for 18 hours with an epigenetic modifier – 5-Azacitidine (10 µM/ 105 cells). After termination of culture some cells were collected and subjected to immunofluorescence and Western blot analyses in order to confirm the presence of protein markers characteristic for pluripotent stem cells: Oct-4, Sox2 and c-Kit. Then obtained cells like - pluripotent stem cells (cl-pSCs) were subjected to differentiation towards nervous system cells. To do this cl-pSCs were cultured for 14-days in vitro with the presence of forskolin and basal fibroblast growth factor (bFGF). After differentiation culture cells were subjected to immunofluorescence analysis to reveal the presence of selected markers of nervous system cells: NeuN, NPY and GFAP. Results obtained after granulosa cells culture with an epigenetic modifier – 5-Azacitidine, confirmed that they de-differentiated into cells expressing features of pluripotent stem cells This was indicated by the presence of selected protein markers: Oct-4, Sox2, c-Kit, and also their ability to differentiate into nervous system cells. Finally, detection of NeuN and NPY proteins indicates that cl-pSCs differentiated towards neurons while expression of GFAP indicated that they differentiated into astrocytes. To sum up obtained results indicate that epigenetic manipulations with the use of 5-Azacitidine may constitute an efficient, alternative method of cell reprogramming. Thanks to the use of 5-Azacitidine it was possible to obtain from granulosa cells isolated from pig ovarian follicle cells similar to pluripotent stem cells that subsequently were differentiated into nervous system cells. This may contribute to a change in the attitude towards epigenetic manipulations within the scope of regenerative medicine.