Analysis of MCPIP1 and MCPIP3 expression level during the cell cycle

Białka z rodziny MCPIP (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1 Induced Protein) są regulatorami stanu zapalnego. Elementem konserwatywnym w ich strukturze jest domena palca cynkowego (CCCH) i N-terminalna domena PilT (PIN, ang. PilT N-terminus domain), która jest odpowiedzialna za ich aktywność nukleolityczną. Najlepiej scharakteryzowanym białkiem z tej rodziny jest MCPIP1, podczas gdy funkcja pozostałych nie została dokładnie poznana. Wykazano, że poziom białek MCPIP1 i MCPIP3 zmienia się w tkance zmienionej nowotworowo. Wiadomo też, że modulacja ekspresji białka MCPIP1 w różnych typach komórek wpływa na profil cyklu komórkowego. Nie wiadomo, czy mechanizm ten dotyczy innych białek z rodziny MCPIP. Pierwszym celem niniejszej pracy była synchronizacja komórek HeLa metodą podwójnego bloku tymidynowego oraz analiza zmian poziomu ekspresji MCPIP1 i MCPIP3 na poziomie białka i transkryptu w poszczególnych fazach cyklu komórkowego (G1, S, G2/M). W celu sprawdzenia efektywności przeprowadzonej synchronizacji komórki wybarwiono jodkiem propidyny i poddano analizie cytometrycznej. Ilość białka i transkryptu przeanalizowano odpowiednio metodą western blot i PCR w czasie rzeczywistym. Drugi cel stanowiło sprawdzenie żywotności i profilu cyklu komórkowego komórek linii HeLa po wyciszeniu ekspresji MCPIP3. Uzyskane wyniki wykazały, że ilość białka MCPIP3 jest największa w fazie G2/M, z kolei poziom jego transkryptu nie ulega istotnym zmianom w czasie progresji cyklu komórkowego. Różnice w poziomie ekspresji MCPIP1 nie były istotne statystycznie. Analiza żywotności i profilu cyklu komórkowego nie wykazała istotnych statystycznie różnic po wyciszeniu ekspresji MCPIP3. Otrzymane wyniki sugerują, że MCPIP3 może mieć rolę w cyklu komórkowym.

Proteins belonging to the MCPIP (Monocyte Chemoattractant Protein-1 Induced Protein) family are regulators of inflammation. A conservative element in their structure is the zinc finger domain (CCCH) and the N-terminal PilT domain (PIN), which is responsible for their nucleolytic activity. MCPIP1 is the best characterized protein of this family, while the function of the others has not been fully understood. It has been shown that the level of MCPIP1 and MCPIP3 proteins changes in neoplastic tissue. It is also known that modulation of MCPIP1 protein expression in different cell types influences the cell cycle profile. It is not known whether this mechanism applies to other proteins of the MCPIP family. The first aim of this study was synchronization of HeLa cells using the double thymidine block method and analysis of MCPIP1 and MCPIP3 expression changes at the protein and transcript levels in particular phases of the cell cycle (G1, S, G2/M). In order to check the effectiveness of the performed synchronization the cells were stained with propidium iodide and subjected to cytometric analysis. The amount of protein and transcript was analyzed by western blot and quantitative PCR, respectively. The second goal was to check the viability and cell cycle profile of HeLa cells after MCPIP3 silencing. The conducted studies have shown that the amount of MCPIP3 protein reaches the highest level in the G2/M phase, while the level of its transcript does not change significantly during the progression of the cell cycle. MCPIP1 expression level differences were not statistically significant. Analysis of the cell viability and cell cycle profile showed no statistically significant differences after silencing of MCPIP3. The obtained results suggest that MCPIP3 protein may have a role in the cell cycle progression.