Analysis of the properties of the recombinant protein - the scFv monoclonal antibody dedicated to the transport of antipsychotic substances to defined areas in the brain tissue

Schizofrenia należy do grupy zaburzeń psychicznych o charakterze przewlekłym. Dotyka ona około 1% populacji na świecie. Pomimo licznych badań ludzkość wciąż nie dysponuje skutecznymi terapiami tej choroby, które nie powodują skutków ubocznych. W celu ograniczenia działań niepożądanych i zwiększenia wydajności leczenia rozwijane są terapie celowane. Strategia tych terapii opiera się na wykorzystaniu trzech elementów: ligandów kierunkowych, nośników oraz cząsteczki terapeutycznej. Celem ligandu kierunkowego jest selektywne rozpoznawanie ściśle zdefiniowanych epitopów. Przykładem takiej cząsteczki jest przeciwciało monoklonalne scFv, które zostało zaprojektowane tak, aby łączyło się jedynie z heteromerami receptora dopaminowego typu 2 i serotoninowego typu 1A (D2-5-HT1A). Współcześnie jedyne zdefiniowane miejsca występowania obu tych typów receptorów jednocześnie to kora przedczołowa i hipokamp, czyli miejsca kluczowe w patogenezie schizofrenii. Ponadto doniesienia literaturowe sugerują istotną rolę tego heteromeru w nowoczesnej terapii schizofrenii. Ważne jest zatem, aby leki przeciwpsychotyczne oddziaływały jedynie z wyżej wymienionymi ośrodkami w mózgu, przez co można zwiększyć wydajność leczenia przy jednoczesnej znacznej eliminacji skutków ubocznych.Głównym celem pracy było opracowanie wydajnego systemu ekspresji i oczyszczania wariantu przeciwciała monoklonalnego scFv specyficznie rozpoznającego heteromer D2-5-HT1A, a następnie wyznaczenie jego właściwości biochemicznych i biologicznych. W celu wyprodukowania białka sprawdzono dwa szczepy E. coli: HB2151 oraz Rosetta Blue. Oprócz tego subklonowano sekwencje odpowiadające przeciwciału scFv z wektora pIT2 do wektora pET-scFv-T. Następnie zoptymalizowano ekspresję białka. Umożliwiło to dalsze badania w kierunku opisania właściwości biochemicznych, tj. wyznaczenie struktur II-rzędowych metodą dichroizmu kołowego. Kolejnym etapem było zapoczątkowanie eksperymentów związanych z właściwościami biologicznymi. Pierwszym krokiem w tym kierunku było określenie, czy przeciwciało jest neutralne w stosunku do neutrofili. Jest to ważne z perspektywy ograniczenia skutków ubocznych w leczeniu schizofrenii, gdyż jednym z najpoważniejszych działań niepożądanych agranulocytoza występująca po podaniu klozapiny – jednego z najlepiej działających leków przeciwpsychotycznych.Wyniki doświadczalne otrzymane w pracy pozwalają na rozwinięcie badań w kierunku wykorzystania uzyskanego białka jako ligandu kierunkowego. W przyszłości może być ono użyte do terapii schizofrenii, znacząco przyczyniając się do poprawy farmakoterapii tej choroby.

Schizophrenia belongs to the group of chronic mental disorders. It affects about 1% of the world's population. Despite numerous studies, mankind still does not have effective treatments for this disease that do not cause side effects. Targeted therapies are being developed to reduce side effects and increase treatment efficacy. The strategy of these therapies is based on the use of three elements: targeting ligands, carriers and a therapeutic molecule. The purpose of the targeting ligand is to selectively recognize well-defined epitopes. Such a molecule is the scFv monoclonal antibody, which has been designed to bind only to dopamine type 2 and serotonin type 1A (D2-5-HT1A) receptor heteromers. Currently, the only defined places of occurrence of both these types of receptors at the same time are the prefrontal cortex and the hippocampus, i.e. key places in the pathogenesis of schizophrenia. Moreover, literature reports suggest an important role of this heteromer in the modern therapy of schizophrenia. Therefore, it is important that antipsychotic drugs interact only with the above-mentioned centres in the brain, which can increase the efficiency of treatment with a simultaneous significant elimination of side effects. The main goal of the work was to develop an efficient expression system and purification of a variant of the scFv monoclonal antibody specifically recognizing the D2-5-HT1A heteromer, and then determining its biochemical and biological properties. In order to produce the protein, two strains of E. coli were tested: HB2151 and Rosetta Blue. In addition, the sequences corresponding to the scFv antibody from the pIT2 vector were subcloned into the pET-scFv-T vector, then the protein expression was optimized. This allowed for further research aimed at describing biochemical properties, i.e. the determination of secondary structures using the circular dichroism method. The next step was the initiation of experiments related to biological properties. The first step in this direction was to determine if the antibody was neutrophil neutral. It is important from the perspective of reducing side effects in the treatment of schizophrenia, as one of the most serious side effects is agranulocytosis following the administration of clozapine – one of the most effective antipsychotic drugs.The experimental results obtained in the work allow for the development of research towards the use of the obtained protein as a directional ligand. In the future, it can be used in the treatment of schizophrenia, significantly contributing to the improvement of pharmacotherapy of this disease.