Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD - Duchenne muscular dystrophy) jest najczęściej występującą formą dystrofii mięśniowej, szacuje się, że cierpi na nią 1 na 5000-6000 chłopców. DMD jest recesywną chorobą genetyczną sprzężoną z chromosomem X, powstaje wskutek mutacji w genie kodującym dystrofinę - ważne białko cytoszkieletowe stanowiące główny element kompleksu dystrofina-glikoproteiny. Kompleks ten odpowiada za utrzymanie integralności komórki, zapewniając mechaniczne połączenie pomiędzy cytoszkieletem aktynowym, a macierzą zewnątrzkomórkowa. Utrata dystrofiny zakłóca funkcjonowanie tego kompleksu, prowadząc do niestabilności sarkolemmy, co czyni ją bardziej podatną na uszkodzenia. W konsekwencji wywołuje to nekrozę włókien mięśniowych, chroniczny stan zapalny, zaburzenia procesu regeneracji, które prowadzą do wyczerpania puli mięśniowych komórek satelitarnych (mSCs), a w końcu do zastąpienia tkanki mięśniowej tkanką włóknistą i tłuszczową. Procesy te są wynikiem braku dystrofiny i dodatkowo przyczyniają się do pogłębienia uszkodzeń, prowadząc do atrofii mięśni, utraty ich funkcji, a ostatecznie do przedwczesnej śmierci na skutek niewydolności krążeniowo-oddechowej. Mimo, iż wiele terapii genowych mających na celu przywrócenie ekspresji dystrofiny jest obecnie opracowywanych, farmakologiczne leczenie wykorzystujące kortykosteroidy, leki o właściwościach przeciwzapalnych, jest nadal złotym standardem w opiece nad pacjentami z DMD. Jednak, pomimo korzystnego wpływu na funkcjonowanie mięśni, poprawiającego jakość i długość życia pacjentów, powodują wiele skutków ubocznych. Dlatego określenie nowych celów terapii przeciwzapalnej może przyczynić się do opracowania skuteczniejszych strategii terapeutycznych. Wcześniejsze badania naszej grupy wykazały, że oksygenaza hemowa 1 (HO-1), białko rozkładające hem, hamuje różnicowanie mioblastów i może odgrywać ochronną rolę w DMD poprzez wpływ na stan zapalny oraz regulując różnicowanie mSCs. Czynnik transkrypcyjny Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor) odgrywa w komórce kluczową rolę cytoprotekcyjną, poprzez interakcję z sekwencją ARE (Antioxidant Response Element) zlokalizowaną w regionach promotorowych, reguluje ekspresję genów o właściwościach przeciwutleniających i przeciwzapalnych. Celem prezentowanej pracy było zatem określenie wpływu Nrf2 induktora ekspresji HO-1, na właściwości mioblastów, a także jego roli w ostrym i chronicznym uszkodzeniu mięśni w DMD oraz ostrym uszkodzeniu po nastrzyknięciu kardiotoksyną (CTX). W pierwszym etapie badań przeprowadzono doświadczenia wykorzystując i) unieśmiertelnioną linię mysich mioblastów (C2C12), poddanych transdukcji wektorami retrowirusowymi, tak by uzyskać stabilną ekspresję Nrf2 oraz ii) pierwotne komórki satelitarne wyizolowane z myszy o różnym genotypie. W doświadczeniach in vitro wykazano, że nadekspresja Nrf2 promuje proliferację i przeżywalność mioblastów w warunkach stresu oksydacyjnego oraz zmniejsza produkcję reaktywnych form tlenu. Ponadto zaobserwowano, że Nrf2 silne hamuje różnicowanie mioblastów, ekspresję miogenicznych czynników regulatorowych (MRFs) oraz mięśniowo-specyficznych mikroRNA. Co ciekawe, wykazaliśmy, że komórki satelitarne wyizolowane z myszy pozbawionych aktywnego transkrypcyjnie Nrf2 (Nrf2tKO) i hodowane in vitro w atmosferycznym stężeniu tlenu wykazują wysoką śmiertelność. Natomiast, komórki poddane różnicowaniu in vitro w warunkach hipoksji były żywe i dużo bardziej zróżnicowane niż komórki wyizolowane z myszy typu dzikiego (WT). W kolejnym etapie badań sprawdzono wpływ braku aktywności transkrypcyjnej Nrf2 w ostrym i przewlekłym uszkodzeniu mięśni. W tym celu mięsień brzuchaty łydki myszy typu dzikiego oraz myszy pozbawionych aktywnego transkrypcyjnie Nrf2 został nastrzyknięty uszkadzającą mięśnie CTX. W wyniku zastosowania CTX stwierdzono nieznacznie zwiększone uszkodzenie mięśni u myszy Nrf2tKO w porównaniu do myszy WT. Kolejne etapy badań dotyczyły określenia roli Nrf2 w progresji DMD. W tym celu w eksperymentach wykorzystano cztery genotypy myszy: typu dzikiego, pozbawione aktywnego transkrypcyjnie Nrf2 (Nrf2tKO), dystroficzne myszy mdx, które stanowią mysi model DMD oraz unikatowe tzw. podwójne nokauty, pozbawione zarówno dystrofiny, jak i aktywnego transkrypcyjnie Nrf2 (Nrf2tKOmdx). Przeprowadzono liczne analizy w kontekście najbardziej charakterystycznych procesów patologicznych zachodzących w przebiegu DMD, jak: uszkodzenie, zapalenie, zwłóknienie oraz regeneracja mięśni. W badaniach wykazano, że brak aktywności transkrypcyjnej Nrf2 nie wpływa na pogorszenie fenotypu dystroficznego. Ponieważ jednak przebieg dystrofii u myszy mdx jest znacznie łagodniejszy od tego, który jest obserwowany u ludzi, dlatego w kolejnym etapie badań zwierzęta poddano długotrwałym ćwiczeniom wysiłkowym na bieżni w celu zaostrzenia choroby. Zaobserwowano wówczas zwiększone uszkodzenie oraz stan zapalny w mięśniu brzuchatym łydki myszy Nrf2tKOmdx w porównaniu do myszy mdx, co nie było natomiast widoczne w przeponie. Podsumowując, eksperymenty in vitro wskazują na znaczącą rolę czynnika transkrypcyjnego Nrf2 w mioblastach i pierwotnych komórkach satelitarnych. Jednakże wykazano, że brak aktywności transkrypcyjnej Nrf2 ma umiarkowany wpływ na procesy patologiczne zachodzące w mięśniach w różnych modelach uszkodzenia.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common form of muscular dystrophies that affects 1 in 5000-6000 boys. DMD is a genetic, X-chromosome linked disease caused by the mutations in the DMD gene encoding dystrophin, important cytoskeleton protein, which is the major element of the dystrophin-glycoprotein complex (DGC). DGC is responsible for maintaining cellular integrity, providing the mechanical link of the intracellular cytoskeleton with the extracellular matrix. The loss of dystrophin disrupts the complex, leading to sarcolemmal instability and inducing muscle damages. Consequently it results in muscle necrosis, extensive inflammation, disturbance of regeneration process, related to the depletion of progenitor cells (muscle satellite cells - mSCs) and finally to replacement of skeletal muscles by fibrotic or adipose tissue. Those processes contribute significantly to disease progression aggravating final outcome and leading to muscle atrophy, loss of muscle function, and ultimately to patients' premature death due to cardio-respiratory failures. Although many gene therapies aiming the restoration of dystrophin are being developed, treatment with corticosteroids, anti-inflammatory agents, is still the gold standard of care for DMD patients. Despite the fact that corticosteroids improve the length and quality of patients' life, their prolonged use can cause serious side effects. Therefore, identifying a new target for anti-inflammatory treatment might contribute to the development of novel therapeutic strategies. In previous studies, we have shown that heme oxygenase 1 (HO-1), a heme-degrading protein, inhibits myoblasts differentiation and might play a protective role in DMD modulating inflammation and regulating differentiation of mSCs. Nrf2 transcription factor, that is the major regulator of other anti-oxidant and anti-inflammatory genes interacting with antioxidant response element (ARE) located in their promoter region, including HO-1. Therefore, in the current research, we aimed to study its role in myoblast biology, chronic injury in DMD as well as in acute myodamage. In the first stage of research, we used i) an immortalized cell line of mice myoblasts (C2C12) which were transduced using retroviral vectors to obtain stable expression of Nrf2, and ii) primary mSC isolated from mice of different Nrf2 genotypes. In vitro experiments revealed that Nrf2 promoted myoblasts proliferation and cell viability under oxidative stress condition, as well as decreased production of reactive oxygen species (ROS). Moreover, Nrf2 was found to inhibit differentiation of C2C12 cells decreasing expression of myogenic regulatory factors (MRFs), and muscle-specific microRNAs. Interestingly, we showed also that Nrf2 is indispensable for the viability of mSCs, as lack of its transcriptional activity caused high mortality of cells cultured in vitro in normoxic conditions, whereas mSCs cultured and differentiated in hypoxic condition were viable and much more differentiated in comparison to cells isolated from wild-type mice. In the next step of research, we checked the effect of Nrf2 transcriptional deficiency during acute and chronic muscle injury. Firstly, the gastrocnemius muscle of wild-type (WT) animals and mice lacking transcriptionally active Nrf2 (Nrf2tKO) were injected with cardiotoxin (CTX). We found slightly increased muscle damage in Nrf2tKO mice in comparison to WT counterparts. To investigate the role of Nrf2 in the progression of DMD, experiments were performed on mice of four genotypes: wild type, lacking transcriptionally active Nrf2, mdx mice lacking dystrophin, which are a mouse model of DMD and double knockouts - mice lacking both dystrophin and lacking transcriptionally active Nrf2 (Nrf2tKOmdx). We performed an extensive analysis of muscle functionality and the main pathological features of DMD such as muscle degeneration, inflammation, regeneration, and fibrosis. However, transcriptional ablation of Nrf2 in mdx mice did not aggravate the dystrophic phenotype. Moreover, as mdx mice exhibit quite mild phenotype in comparison to human patients, animals were subjected to long-term treadmill exercises to exacerbate dystrophic condition. Then we observed increased degeneration and inflammation in gastrocnemius muscle, but not in diaphragm in Nrf2tKOmdx in comparison to mdx mice. In conclusion, in vitro experiments showed that Nrf2 significantly influences the properties of myoblast and muscle satellite cells. However, the lack of transcriptionally active Nrf2 only moderately affects muscle pathology in various models of muscle injury.