Design of SERS nanosensors for detection of markers of diseases

Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Selektywna i szybka detekcja biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych ma zasadnicze znaczenie w wykrywaniu chorób, wdrażaniu skutecznego leczenia oraz monitorowania skuteczności wprowadzanych terapii. Rozwój narzędzi diagnostycznych, które umożliwiają ich lokalizację, a także ilościową ocenę z wysoką czułością i niezawodnością, przyczyniają się do lepszej i szybszej diagnostyki, co ma ogromny wpływ na rokowania pacjenta i jego szanse przeżycia. Testy oparte na reakcjach immunologicznych są jednymi z najczęściej stosowanych metod w wielu obszarach diagnostyki klinicznej oraz badań naukowych, służąc detekcji składników takich jak specyficzne białka, hormony czy leki. Testy immunologiczne odgrywają kluczową rolę w wykrywaniu biomarkerów związanych z rozwojem wielu chorób i zaburzeń ze względu na ich wysoką czułość i selektywność. W ostatnim czasie szczególnie wiele uwagi poświęca się na testom immunologicznym opartym na detekcji i kwantyfikacji sygnału generowanego dzięki powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii ramanowskiej (SERS). Silne wzmocnienie sygnału ramanowskiego wynikające z wykorzystania nanostruktur metalicznych umożliwia wykrywanie biomarkerów na bardzo niskim poziomie stężeń, a w połączeniu z reakcjami immunologicznymi możliwe jest skonstruowanie czujników do selektywnego wykrywania interesujących badacza składników próbki. Celem prowadzonych w ramach niniejszej pracy badań naukowych była konstrukcja sensorów do detekcji stanu zapalnego w tkankach oraz płynach biologicznych i realizowany był on poprzez dwie ścieżki badawcze. Pierwsza z nich poświęcona była opracowaniu czujników immunoSERS do selektywnego wykrywania markerów w tkance aorty z rozwiniętą miażdżycą. Aby to osiągnąć testowano różnego rodzaju nanocząstki złota oraz sposoby barwienia (metodą bezpośrednią i pośrednią). Ostatecznie opracowano protokół, który umożliwił poprawną detekcję komórek mięśniówki gładkiej, jednego z kluczowych elementów blaszki miażdżycowej. Bardzo ważnym aspektem było przeprowadzenie analizy ilościowej badanego markera, a także wykonanie jednoczesnej detekcji dwóch markerów w aorcie. W ramach drugiej ścieżki badawczej realizowano założenia konstrukcji czujnika do ilościowej oceny mediatorów zapalnych, których poziom zmienia się na długo przed wystąpieniem objawów choroby. Projektowany sensor składał się z dwóch głównych części. Pierwsza z nich obejmowała metaliczne podłoże zmodyfikowane w taki sposób, aby wychwycić badany analit z roztworu. Z kolei drugą z nich stanowiła immunosonda SERS, rozpoznająca analit unieruchomiony na podłożu i generujący sygnał SERS. W ten sposób stworzony sensor przypomina w budowie powszechnie stosowany test kanapkowy ELISA. Punktem wyjścia w tej ścieżce badawczej było testowanie różnych podłoży metalicznych, a następnie wybranie tych o najlepszych właściwościach SERS do budowy sensora. W kolejnym kroku opracowano i zoptymalizowano metodę modyfikacji zarówno stałego podłoża SERS jak i koloidalnych nanocząstek metalicznych, aby stworzyć kompletny czujnik kanapkowy. Co więcej zbudowano dwa systemy testów kanapkowych - konwencjonalny z użyciem jednego reportera ramanowskiego umiejscowionego w immunosondzie oraz z zastosowaniem dwóch reporterów - jednego związanego z immunosondą, a drugiego z podłożem stałym. Ostatnim etapem prowadzonych badań była ocena działania obu rodzajów sensorów oraz stworzenie krzywych kalibracyjnych dla interleukiny 6 w zakresie stężeń od 0 do 1000 pg/mL dla wybranych czujników. Na podstawie prowadzonych eksperymentów stwierdzono, że układ z dwoma reporterami ramanowskimi charakteryzuje się większą czułością w detekcji badanej interleukiny w stosunku do sensora opartego na jednym reporterze ramanowskim.

Selective and rapid detection of biomarkers in complex biological samples is essential in disease recognition, effective treatment and monitoring of the therapy efficacy. Development of diagnostic tools which enable detection and qunatification with high sensitivity and selectivity, could provide accurate and fast diagnosis. The latter plays a pivotal role on the patient’s prognosis and chance of survival. Immunoassay is one of the most common method for the analysis of biochemical targets such as specific proteins, nuclei acids, hormones or drugs. And it has been routinely employed in many areas of clinical diagnostics and life -science research. As a robust and sensitive technique, immunoassay plays a key role in the detection of disease and disorder-associated biomarkers. Recently, surface enhanced Raman scattering (SERS) is increasingly considered as an ultrasensitive and rapid assay readout in the immunoassay techniques. Because of strong enhancement of Raman signal due to plasmonic features of metallic substrates, this technique is extremely useful in detection of biomarkers even at ultra-low concentrations. Based on immunological reaction, it is possible to construct a SERS sensor for the selective detection of various targets of interests. The main scientific goal of the doctoral thesis was to design immunosensors for detecting specific inflammation markers in tissues and biological fluids. This aim was realized through two research paths. The first one was devoted to the development of immunoSERS sensors for the selective detection of markers in aortic tissue with developed atherosclerosis. To achieve that, various types of nanostructures and staining approaches (direct and indirect methods) were tested. Designed immunoSERS probes allowed for the localisation of smooth muscle cells, one of the key components of atherosclerotic plaque. A very important aspect was to perform the quantitative analysis of the tested marker as well as the simultaneous detection of two markers within the same tissue. Another essential direction of the doctoral thesis was to design a diagnostic test for the quantitative detection of inflammatory mediators in blood plasma as their level can increase before disease symptoms. The SERS-based immunoassay platform involved two parts. The first one included a capture surface modified with specific antibodies that bind antigen from a sample, while the second part is based on a SERS immunoprobe which recognizes the analyte immobilized on the substrate and provides SERS readout. This construction resembles the commonly used ELISA sandwich test. The starting point for this research path was to test various metallic substrates and then select those with the high SERS properties. In the next step, a method for modifying both the substrate and metallic nanoparticles was developed and optimized to construct a complete sandwich sensor. Moreover, two types of the sandwich strategy were evaluated – the conventional design with one Raman reporter conjugated with metal nanoparticles and with two Raman reporters conjugated with metal nanoparticles and metal solid film. The last step of the research was to evaluate analytical performance of the designed SERS sandwich sensors based on calibration curves for interleukin 6 in the concentration range from 0 to 1000 pg/mL. It was found that the assay with the dual -reporter and dual SERS enhancement systems exhibit a better sensitivity in detection of investigated interleukin compared to the sensor with one Raman reporter only.