Structural studies of GlyT-1 and GlyT-2 glycine transporters with computational methods

Część teoretyczna niniejszej pracy magisterskiej opisuje transportery glicynowe GlyT-1 oraz GlyT-2. Poruszono kwestie ich roli, lokalizacji neuroanatomicznej i komórkowej, a także regulacji. Szczególną uwagę poświęcono budowie molekularnej i mechanizmowi działania obu transporterów oraz zmianom konformacyjnym zachodzącym w trakcie transportu substratu przez błonę. Praca zawiera również krótki spis najważniejszych inhibitorów obu transporterów oraz opis schorzeń, dla których transportery glicynowe mogłyby być potencjalnymi celami terapeutycznymi. W części eksperymentalnej za pomocą techniki modelowania molekularnego zbudowano modele ludzkich transporterów GlyT-1 i GlyT-2. Jako matryc użyto struktur krystalicznych transporterów dopaminowych z muszki owocowej, ludzkiego transportera serotoninowego i niedawno wykrystalizowanego, ludzkiego GlyT-1, w różnych stanach konformacyjnych. Zbudowano serię modeli w Swiss Model oraz programie Modeller, które następnie oceniono za pomocą funkcji oceniających: Procheck, Verify3D, QMEAN i DOPE Score. Dla najlepiej ocenionych modeli przeprowadzono również weryfikacje przez dokowanie znanych inhibitorów. Następnie porównano miejsce wiązania transporterów w dwóch stanach konformacyjnych, otwartych na zewnątrz lub do wewnątrz komórki, ze zwróceniem szczególnej uwagi na różnice między GlyT-1 a GlyT-2, które mogłyby tłumaczyć selektywne działanie inhibitorów. Założono, że związki hamujące transportery GlyT w sposób kompetycyjny będą się wiązać w konformacji otwartej na zewnątrz, a inhibitory niekompetycyjne – w konformacji otwartej do wnętrza komórki. Hipotezę tę zweryfikowano przez dokowanie w programie Glide serii inhibitorów do wybranych modeli i ocenę trybu wiązania związków w obu konformacjach. Uzyskane wyniki stanowią interesujący punkt wyjścia do dalszych badań transporterów GlyT-1 i GlyT-2, które mogą zaowocować zaprojektowaniem nowych, selektywnych inhibitorów dla obu transporterów.

The theoretical part of this thesis describes the glycine transporters GlyT-1 and GlyT-2. Their role, neuroanatomical and cellular localization as well as regulation were discussed. Particular attention was paid to the issue of molecular structure and the mechanism of action of both transporters as well as conformational changes occurring during the transport of the substrate through the membrane. The work also includes a short list of the most important inhibitors of both transporters and a description of diseases for which glycine transporters could be potential therapeutic targets.In the experimental part, models of the human GlyT-1 and GlyT-2 transporters were built using the molecular modeling technique. Crystal structures of dopamine transporters from Drosophila melanogaster, the human serotonin transporter and recently crystallized, human GlyT-1, in various conformational states were used as templates. Series of models were built in the Swiss Model and Modeller, which were then assessed using the evaluation functions: Procheck, Verify3D, QMEAN and DOPE Score. For the best-rated models docking verifications of known inhibitors were also performed. Then binding of the transporters in the two conformational states, open to the outside or inside the cell, was compared, paying particular attention to differences between GlyT-1 and GlyT-2 that could explain the selective action of the inhibitors. It was assumed that competitive inhibitors bind in the outward-open conformation, while non-competitive inhibitors prefer transporter facing inside of the cell. This hypothesis was verified by docking the series of inhibitors to best-rated models in the Glide software and evaluating the binding mode of compounds in both conformations.The obtained results constitute an interesting starting point for further studies of the GlyT-1 and GlyT-2 transporters, which may result in the design of new, selective inhibitors for both transporters.