Effects of detergents on adenylyl cyclase inhibitory G proteins solubilization and isolation from plasma membrane

W błonach komórkowych znajdują się kompartmenty o różnej stabilności i rozmiarze, będące środowiskiem faworyzującym lokalizację określonych cząstek hydrofobowych oraz wykazujących do nich powinowactwo białek integralnych i podbłonowych, wśród nich lipidowanych białek G. W szlakach sygnalizacji zależnych od receptorów GPCR jednym z kluczowych przełączników jest badane białko G hamujące cyklazę adenylanową. Wśród funkcjonujących u człowieka podjednostek występujących w różnych tkankach wybrano heterotrimer związany z układem nerwowym: Gαi3 Gβ1 Gγ2. Badane Gαi3 z kotwicą N-mirystylową i S-palimitylową podlega oddziaływaniom lokalizującym do obszarów błon wzbogaconych w nasycone kwasy tłuszczowe, sfingolipidy oraz cholesterol. Tworząca dimer Gβ1γ2 podjednostka Gγ2 jest prenylowana łańcuchem S-geranylogeranylu, przez co preferuje fazy nieuporządkowane związane z wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi. W pracy przedstawiono efektywność solubilizacji białek z użyciem detergentów, którą porównano z rozkładem średnic hydrodynamicznych w różnych układach micelarnych. Aby proces solubilizacji błon komórek Hi5 był skuteczny, wymagane było spełnienie szeregu warunków, poczynając od homogenizacji osadu po spełnienie różnych preferencji rozpuszczalności dla Gαi3 i Gβ1γ2. Sprawdzono wydajność różnych metod izolacji białek w tym wpływ kombinacji surfaktantów i innych składników na oddziaływania białek z lipidami. Zbadano wpływ zubożenia cholesterolu w błonach i suplementacji jego estru z kwasem bursztynowym na efekty izolacji podjednostek G. Zmiennymi czynnikami fizycznymi były metody rozdrabniania błon, temperatura i czas. Zaobserwowano, że dla wydajnej izolacji białka G korzystne było wstępne oczyszczanie błon w buforach zawierających glukozyd kokosowy lub metylo-β-cyklodekstrynę. Najlepsze efekty sekwencyjnej solubilizacji osiągano z detergentem fosfocholinowym (Fos-Cholina-12) i hemibursztynianem cholesterylu. Otrzymane wyniki wskazują, że do detergentu należy też dopasować energię ultradźwięków, temperaturę i czas homogenizacji. Wydajność izolacji białka potwierdzano specyficznymi przeciwciałami w metodzie western blot. Wyniki porównano z rozmiarami miceli określonymi przy zastosowaniu dynamicznego rozpraszania światła oraz z wartościami z literatury przedmiotu. Wyniki badań dotyczyły błon komórek owadzich, dlatego omówiono też powinowactwo białek G do lipidów w komórkach ludzkich. Przeanalizowano możliwość uszkadzania lipidowanych białek G in vitro oraz in vivo oraz zaproponowano dalsze badania w modelach fizjologicznych i patologicznych.

Investigated heterotrimeric G protein is composed of Gαi3, Gβ1, and Gγ2 subunits, which are found especially within nervous tissues. They take part in signal transduction from G protein-coupled receptors, causing inhibition of adenylyl cyclase, while being dynamically regulated by their environment. Cellular membrane domains are various complexes of lipids with specific integral and peripheral proteins. They may be instrumental in organizing cellular functions and involve G proteins posttranslationally modified with hydrocarbon chains, a pivotal membrane-bound protein. This heterotrimer processing involves S-palmitoylation and N-myristoylation of Gαi3, also geranylgeranylation of Gγ2. Membrane localization is governed by these lipid anchors, and interactions are changed on the molecular level, with saturated fatty acids, sphingolipids, cholesterol, etc.This research focused on the efficacy of protein solubilization and isolation from plasma membranes biosynthesized in Hi5 insect cells. These processes depended on physico-chemical interactions studied in vitro, and conclusions were correlated with extensive in vivo literature research. Physical factors were adjusted with different incubation temperatures, homogenization rigour, ultrasonic energy, etc. In these experiments conditions were checked agains a large set of buffers, combining many types of surfactants.The most efficient G protein isolation was done after membranes pre-purification in buffers containing coco-glucosides or methyl-β-cyclodextrin. The subsequent solubilization was done with Fos-Choline-12 and cholesteryl hemisuccinate. Delivering higher-power ultrasonic energy had its benefits and drawbacks, but results highly depended on detergents. Protein isolation efficacy was confirmed with specific antibodies with the western blot method. The results were compared with micelle size distributions determined using dynamic light scattering and compared to literature. Obtained results concerned insect cells membranes, therefore affinity of G proteins to human membrane domains was also discussed. The possibility of damaging lipidated G proteins in vitro and in vivo was analysed, and further studies in physiological and pathological models were proposed.