Immunoprecipitation of human N4BP1 protein complexes and determination of its intracellular localization in HEK 293 cell line

Białko N4BP1 (ang. NEDD4 Binding Protein 1) należy do rodziny białek N4BP. Ich wspólną cechą jest oddziaływanie z E3 ligazą ubikwityny NEDD4 (ang. Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 4). W skład N4BP1 wchodzi domena KH (ang. K Homology domain), odpowiedzialna za wiązanie RNA, domena o aktywności rybonukleolitycznej NYN (ang. N4BP1, YacP-like Nuclease domain) oraz tzw. domena CoCUN (ang. Cousin of CUBAN), która odpowiada za wiązanie reszt ubikwityny. N4BP1 zostało zidentyfikowane jako inhibitor ligazy ubikwityny Itch (ang. E3 ubiquitin-protein ligase Itchy homolog), a kolejne badania dowiodły o istotnej roli tego białka w regulacji przekazu sygnału do czynnika transkrypcyjnego NFκB (ang. Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) czy w degradacji wirusowego mRNA. Według danych literaturowych N4BP1 lokalizuje się głównie w jądrze komórkowym, wewnątrz jąderka oraz w strukturach zwanych ciałkami jądrowymi PML (PML NBs ang. Promyelotic Leukemia Nuclear Bodies). Samo białko może ulegać degradacji proteasomalnej wewnątrz ciałek PML lub proteolitycznej przy udziale proteaz cysteinowych – kaspazy 8 oraz MALT1 (ang. Mucosa-Associated lymphoid tissue lymphoma translocation 1). Celem pracy było opracowanie optymalnej metody immunoprecypitacji N4BP1, zbadanie wpływu tego białka na żywotność komórek z wykorzystaniem testu MTT oraz określenie lokalizacji N4BP1 w komórkach HEK 293. Badania przeprowadzone w ramach niniejszej pracy pozwoliły na uzyskanie wydajnego systemu oczyszczania białka N4BP1 w oparciu o immunoprecypitację z wykorzystaniem białek fuzyjnych N4BP1 z GFP (ang. Green Fluorescent Protein, białko zielonej fluorescencji) i N4BP1 z fragmentem łańcucha ciężkiego przeciwciała IgG1 (N4BP1-IgG1 Fc). Ponadto komórki z nadekspresją N4BP1 wykazywały istotnie niższą żywotność w porównaniu do komórek kontrolnych. Wykorzystanie systemu N4BP1-GFP oraz mikroskopii fluorescencyjnej do zbadania lokalizacji wewnątrzkomórkowej N4BP1 ujawniło, iż w warunkach nadekspresji N4BP1 preferencyjnie lokuje się poza jądrem komórkowym w granularnych strukturach. Wskazuje to na istotną rolę białka N4BP1 w procesach zachodzących w cytozolu komórkowym.

NEDD4 Binding Protein 1 (N4BP1) belongs to the N4BP protein family. Their common feature is interaction with E3 ubiquitin ligase NEDD4 (Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 4). N4BP1 consists of K-homology domain (KH domain), responsible for interaction with RNA, NYN (N4BP1, YacP-like Nuclease domain) domain with ribonucleolitic activity and so-called CoCUN (Cousin of CUBAN) domain, that binds ubiquitin residues. N4BP1 was identified as an E3 ubiquitin-protein ligase Itchy homolog (Itch) inhibitor. Further studies proved that N4BP1 plays an essential role in many important processes, including immunological response and signal transduction to NFκB transcription factor. N4BP1 also degrades viral mRNA species. According to literature, N4BP1 localizes primarily in the nucleolus or in structures called promyelotic leukemia nuclear bodies (PML NBs). N4BP1 itself is degraded in proteasomal or protelitic dependent manner. Proteasomal degradation occurs mainly in PML NBs. Furthermore two of the cystein proteases – caspase 8 and MALT1 were proved to cleave N4BP1. The aim of the study was finding optimal conditions for immunoprecipitation of N4BP1 complexes, assesment of the role of this protein in cell viability and its cellular localization. The experiments conducted on this work allowed to elaborate an efficient method for N4BP1 purification based on immunoprecipitation, with the use of two fusion protein systems (N4BP1-GFP and N4BP1-IgG1 Fc – IgG1 heavy chain fragment). N4BP1 overexpression significantly decreased cell viability as compared to control. N4BP1-GFP system was used to investigate the intracellular localization of N4BP1. Overexpressed N4BP1 was found to preferentially localize outside the nucleus, forming a granular structures. The data indicate that N4BP1 plays an important role in the processes taking place in cytosol.