Glycosylation of serum proteins in Hashimoto's disease : structural and functional analysis

Dostęp do publikacji jest możliwy w Archiwum UJ

Choroba Hashimoto (Hashimoto's thyroiditis, HT) należy do grupy autoimmunizacyjnych chorób tarczycy (AITD). Rozwój HT związany jest z utratą tolerancji immunologicznej na własne antygeny tarczycy, co prowadzi do wnikania aktywowanych limfocytów do tkanki tego gruczołu i powoduje niszczenie komórek pęcherzykowych (tyreocytów). W efekcie dochodzi do spadku produkcji hormonów, czyli stanu niedoczynności tarczycy. HT charakteryzuje się obecnością w surowicy przeciwciał skierowanych przeciw własnym antygenom tarczycy, peroksydazie tarczycowej (TPO) i tyreoglobulinie (Tg). Przyczyną zniesienia tolerancji na własne antygeny i rozwoju choroby Hashimoto są czynniki genetyczne oraz środowiskowe. Zmiany zachodzące na poziomie molekularnym oraz konsekwencje funkcjonalne tych zmian są słabo poznane. Jednym z niezbadanych dotychczas aspektów tej choroby są zmiany w procesie glikozylacji białek. Celem przeprowadzonych badań była analiza strukturalna W-glikanów białek surowicy oraz ocena funkcjonalna zmian glikozylacji. Badania przeprowadzono na surowicy pacjentów z HT (grupa badana, n=51) i zdrowych dawców (grupa kontrolna, n=61) dobranych pod względem płci i wieku. Dawców z HT rekrutowano na podstawie podwyższonego miana przeciwciał anty-TPO i anty-Tg oraz obrazu USG tarczycy charakterystycznego dla AITD. Metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wykonano ocenę ilościowych zmian zawartości struktur W-glikanów po deglikozylacji białek surowicy między grupą badaną i kontrolną. Metodą spektrometrii mas (MS) określono struktury W-glikanów białek surowicy. Sjalilację i fukozylację białek analizowano również metodą lektynową. Analiza MS wykazała, że frakcja W-glikanów, której zawartość istotnie statystycznie wzrasta w HT, zawiera dwie struktury kompleksowe: jednosjalowaną trzyantenową (A3G3S) oraz dwusjalowaną dwuantenową z fukozą antenową (FA2G2S2). W analizie z użyciem lektyn specyficznych dla fukozy i kwasu sjalowego (SA) stwierdzono istotny statystycznie spadek zawartości rdzeniowej fukozy oraz wzrost a2,3-sjalilacji białek w próbkach surowicy dawców z HT. Analizę funkcjonalną wykazanych w przebiegu HT zmian glikozylacji IgG wykonano na modelach in vitro cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) i cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). Komórkami docelowymi były ludzkie komórki pęcherzykowe tarczycy linii Nthy-ori 3-1 i komórki nowotworowe tarczycy linii FTC-133. Rolę komórek efektorowych w modelu ADCC spełniały komórki monojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zdrowych dawców oraz ludzkie komórki białaczki mieloidalnej linii HL-60. Komórki efektorowe były aktywowane przez przeciwciała klasy G (IgG) izolowane metodą chromatografii powinowactwa od zdrowych dawców i chorych z HT. Źródłem dopełniacza w modelu CDC była surowica pochodząca od zdrowych dawców. W celu oceny roli glikozylacji IgG na efektorowe funkcje przeciwciał cząsteczki IgG poddano działaniu neuraminidazy odcinającej SA od oligosacharydów. Wykazano zwiększoną lizę tyreocytów w obecności IgG od dawców z HT w porównaniu z kontrolą w obu modelach. Desjalilacja IgG nasilała intensywność ADCC oraz zmniejszała lizę w procesie CDC w HT w porównaniu do kontroli. Przeprowadzone badania wskazują, że w przebiegu choroby Hashimoto dochodzi do zmian sjalilacji białek surowicy. Zmieniona w HT glikozylacja IgG jest istotna w procesach niszczenia tyreocytów stanowiących jeden z elementów patologii tej choroby. Uzyskane wyniki stanowią wkład w zrozumienie procesów patologicznych zachodzących w chorobie Hashimoto.

Hashimoto's thyroiditis (HT) is an autoimmune disease characterized by chronic inflammation of thyroid gland. Most of HT patients produce antibodies against thyroid antigens, mainly thyroid peroxidase (TPO) and thyroglobulin (Tg). Anti-thyroid antibodies mediate an immune response which leads to tissue damage and a decrease of thyroid hormone synthesis named as hypothyroidism. One of the mechanism involved in thyroid damage in HT are antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC). W-glycosylation of the Fc fragment affects the effector functions of IgG by enhancing or suppressing the cytotoxic effect. Glycosylation of serum proteins has been found to undergo changes during the progression of different diseases, with autoimmune disorders among them. Genetic and environmental factors are responsible for the breakdown of self-tolerance and the development of HT. Changes at the molecular level and the functional consequences of these alterations are poorly understood. Modifications of glycosylation process are one of the aspects of this disease that has been studied so far to a limited extent. The first aim of the study was to determine the glycosylation pattern of IgG-depleted sera from HT patients. Serum W-glycans were analysed by normal-phase high-performance liquid chromatography (NP-HPLC) and mass spectrometry (MS). Fucosylation and sialylation was also assayed by lectin blotting. Structural analysis of IgG-depleted serum W-glycome showed an increase of monosialylated tri-antennary structure (A3G3S1) and disialylated diantennary W-glycan with antennary fucose (FA2G2S2) in case of HT patients. Lectin blotting analysis demonstrated a significant decrease of Lens culinaris agglutinin (LCA) staining in HT samples, which resulted from the reduction of a1,6-linked core fucose. We also observed an increase of Maackia amurensis II lectin (MAL-II) reaction in HT due to the elevated level of a2,3-sialylation. Our recent study showed a decreased IgG core fucosylation in AITD patients compared to healthy volunteers. The second aim was to assess the impact of HT-specific IgG glycosylation on ADCC and CDC, using in vitro models. The normal thyroid Nthy-ori 3-1 cell line and thyroid carcinoma FTC-133 cells were used as the target cells. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors and the HL-60 human promyelotic leukemia cell line served as the effector cells. IgG was isolated from sera of HT patients and healthy donors and then treated with a2-3,6,8-neuraminidase to cut off sialic acids (SA) from W-glycans. We observed more intensive cytotoxicity in the presence of IgG from HT patients than in the presence of IgG from healthy donors. Removal of SA from IgG W-glycans increased ADCC intensity and reduced CDC. The structural analysis of serum W-glycosylation confirmed that thyroid autoimmunity is accompanied by changes of serum protein sialylation. The detected alterations of serum protein sialylation might be caused by chronic inflammation in HT. The functional analysis completes our previous IgG W-glycosylation analysis in autoimmune thyroid patients. The results of functional tests confirmed that the enhanced thyrocyte lysis resulted from the higher anti-TPO content in the whole IgG pool of HT donors and showed that altered sialylation of IgG affects thyrocyte lysis in both cytotoxicity models. The obtained results demonstrated that the altered glycosylation is characteristic for thyroid autoimmunity and contribute to the understanding of pathological processes occurring in Hashimoto's disease.