Prawidłowe funkcjonowanie wszystkich organizmów żywych zależy od zachowania informacji genetycznej. Genom bez przerwy narażany jest na atak ze strony różnego rodzaju czynników genotoksycznych, pochodzenia wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowego. Szybka i skuteczna naprawa każdego uszkodzenia DNA jest zatem kluczowa dla zachowania integralności informacji genetycznej. W toku ewolucji komórki rozwinęły mechanizmy odpowiedzi na uszkodzenie DNA (ang. DNA damage response, DDR), w których uczestniczą różnorodne systemy naprawcze (m.in. BER, NER, HR, NHEJ) oraz szlaki kaskad sygnałowych. Substratem do naprawy jest uszkodzona matryca DNA, występująca w komórkach eukariotycznych w postaci chromatyny, która zbudowana jest z kwasów nukleinowych oraz białek. W niniejszej pracy doktorskiej skoncentrowano się na badaniach białka HP1, ważnego składnika chromatyny, w kontekście uszkodzenia i naprawy DNA. Heterochromatynowe białka 1 (HP1) zasocjowane są z chromatyną. Cząsteczka HP1 zbudowana jest z dwóch domen: N-końcowej chromodomeny, która wiąże DNA poprzez Me2K9H3 lub Me3K9H3 oraz C-końcowej domeny chromoshadow, zaangażowanej w tworzenie homo- oraz heterodimerów, a także oddziaływań z różnorodnymi białkami jądrowymi. HP1 występuje głównie w heterochromatynie, choć jest również obecne w euchromatynie, i uczestniczy w wielu procesach jądrowych, m.in. w organizacji struktury chromatyny, transkrypcji czy replikacji DNA. Białka HP1 odgrywają istotną rolę w generowaniu i zachowaniu informacji epigenetycznej. W momencie rozpoczęcia doświadczeń opisanych w niniejszej pracy, w literaturze naukowej nie było żadnych informacji na temat udziału białek HP1 w naprawie DNA. Wyniki przeprowadzonych badań pokazują, iż w komórkach ludzkich wszystkie trzy izoformy białka (HP1a, HP1b oraz HP1g) ulegają gromadzeniu w obszarach uszkodzeń DNA. Pomiary prowadzone przy użyciu mikroskopu konfokalnego pozwoliły wykazać, iż proces rekrutacji zależy od temperatury w sposób charakterystyczny dla reakcji enzymatycznych i nie wynika z lokalnej agregacji uszkodzonej chromatyny ani też zatrzymania replikacji. Nagromadzone w miejscu uszkodzenia białko ulega wymianie z jądrową pulą HP1, co świadczy o tym, że w obszarze uszkodzonym jest więcej miejsc wiązania dla cząsteczek białka HP1, choć zgromadzone w rejonie uszkodzenia białko nie jest związane trwale i podlega wymianie z niezwiązaną pulą HP1. Kluczową rolę w procesie gromadzenia HP1 odgrywa C-końcowa domena chromoshadow, co potwierdziły badania wykonane na mutantach delecyjnych oraz białku fuzyjnym ze steryczną blokadą C-końca HP1. Chromodomena HP1 nie wydaje się być bezpośrednio zaangażowana w procesie gromadzenia, co potwierdza brak zarówno wzrostu poziomu Me3K9H3, jak i metylotransferazy histonowej SUV39 w miejscu uszkodzenia. Rola HP1 w naprawie uszkodzenia jest jednak kluczowa, o czym świadczy zwiększenie wrażliwości komórek na UV po utracie tego białka. Gromadzenie HP1 nie zależy od rodzaju uszkodzenia i występuje powszechnie zarówno w miejscach powstałych uszkodzeń oksydacyjnych, DSBs, jak i indukowanych przez UV fotoproduktów 6-4PP oraz CPD. Rekrutacja HP1 nie zależy od funkcjonalnej naprawy NER, ani NHEJ, a jedynie od obecności uszkodzenia. Stosunkowo powolne tempo gromadzenia białka pozwala wykluczyć, że HP1 jest nieznanym dotąd białkiem naprawiającym sekwencję DNA. Gromadzenie partnerów interakcji HP1, wprowadzających zmiany w strukturze chromatyny pozwala przypuszczać, iż HP1 uczestniczy w rearanżacji struktury chromatyny, która może stanowić jeden z procesów mechanizmu DDR. Wydaje się również bardzo prawdopodobne, iż zakumulowane białko HP1 może uczestniczyć w towarzyszącym uszkodzeniu procesie regulacji transkrypcji, gdyż, jak wcześniej wykazano, zahamowanie transkrypcji towarzyszy uszkodzeniu i nie zależy od procesu naprawy DNA. Zaprezentowane w niniejszej rozprawie eksperymenty pokazują niezwykle interesujące zjawisko, jakim jest gromadzenie HP1 w obszarach uszkodzeń DNA. Z całą pewnością badania w tym temacie będą kontynuowane, aż poznany zostanie dokładny molekularny mechanizm odpowiedzi na uszkodzenie, w którym zaangażowane jest HP1.

Maintenance of genome information is crucial for normal functioning of all lively organisms. The genome is constantly facing the action of a variety of genotoxic agents which come from intercellular or extracellular environmental aggressions. Rapid and accurate repair of all DNA lesions is crucial for the protection of the genome integrity. The cellular mechanism of DNA damage response (DDR) has evolved in order to avoid the serious biological consequences of DNA lesions. DDR involves different repair pathways (BER, NER, HR, NHEJ, etc.) and signaling cascades. The substrate for the repair is a damaged DNA template which in eukaryotic cells is organized into chromatin that is composed of nucleic acids and proteins. This doctoral dissertation regards HP1 proteins, the important chromatin constituents, in the context of DNA damage and repair. Chromatin associated heterochromatin protein 1 (HP1) consists of two domains: Nterminal chromodomain, which binds to DNA via Me2K9H3 or Me3K9H3 and C-terminal chromoshadow domain, which is involved in homo- and heterodimers formation as well as interactions with plethora of nuclear proteins. Heterochromatin protein 1 is mainly present in heterochromatin, even though HP1 is also found in euchromatin, and is involved in a number of nuclear processes, among others chromatin organization, transcription or DNA replication. It has been shown that HP1 proteins play an important role in generation and maintenance of epigenetic information in chromatin. When the experiments to this thesis were commenced, there had been no available scientific paper regarding the involvement of HP1 in DNA repair. The results of the experiments demonstrated the recruitment of all three HP1 isoforms: HP1a, HP1b and HP1g, to the DNA damage sites in human cells. Research conducted on confocal microscopy showed that HP1 accumulation depends on temperature similarly to the enzymatic processes and is not a result of local aggregation of the damaged chromatin or stalled replication. HP1 protein recruited to the site of damage can still exchange with the mobile pool of the protein. That observation suggests more HP1 binding sites in the damaged area. Although the recruited HP1 is not stably bound, it is exchanged with the unbound protein. The C-terminal chromoshadow domain is essential for the HP1 accumulation. This has been confirmed by experiments on HP1 deletion mutants as well as fusion proteins with the steric blockade (bulky tag) on C-terminal of HP1. Chromodomain of HP1 appears not to be directly involved in accumulation process, consistent with the lack of increase of Me3K9H3 as well as no recruitment of the histone methyltransferase SUV39 in the damaged site. The increased sensitivity to UV irradiation after the loss of HP1 indicates the crucial role of HP1 protein in the normal DNA damage response. The recruitment of HP1 is independent of the kind of damage introduced and occurs for many types of DNA lesions, among others oxidative damage, DSBs as well as UV-induced 6-4PP and CPD photoproducts. HP1 accumulation to the sites of DNA damage neither require functional NER nor NHEJ and is only triggered by the presence of damage. Rather slow recruitment process indicates that HP1 is not an unknown repair protein involved in DNA sequence restoration. The similar recruitment of several HP1 - interacting proteins, which are involved in remodeling of chromatin, suggests that HP1 might be recruited to damage to re-establish higher order chromatin structure in one of the step in the mechanism of DDR. It is quite likely that accumulated HP1 protein is involved in the regulation of transcription since it was previously demonstrated that the inhibition of transcription after the DNA damaged is independent of the on-going DNA repair process. Experiments described in this thesis are showing very interesting phenomenon - HP1 accumulation in the sites of DNA damage. The further research in this subject will surly by conducted until the entire molecular mechanism of the HP1 - involved DNA damage response is discovered.