In vitro morphogenetic abilities and biochemical activity of Hypericum perforatum L.

Hypericum perforatum L. jest powszechnie znaną i cenioną rośliną ze względu na swoje właściwości przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwzapalne, antyoksydacyjne i przeciwdepresyjne. Jako gatunek zawierający ciekawe metabolity wtórnych, między innymi polifenoli, flawonoidów, karotenoidów i naftodiantronów, stanowi obiekt wielu badań, zarówno ekologicznych, jak i farmakologicznych. Cele niniejszej pracy objęły: w pierwszej kolejności ocenę potencjału morfogenetycznego i uzyskanie wydajnego systemu regeneracyjnego przez zastosowanie różnych kombinacji roślinnych regulatorów wzrostu i rozwoju należących do auksyn i cytokinin, a także porównanie składu chemicznego organów dziurawca oraz czterech naturalnie występujących populacji i zbadanie wpływu warunków in vitro i ex vitro na profil metaboliczny tej rośliny.Materiał roślinny do analizy fitochemicznej zebrano z trzech różnych stanowisk zlokalizowanych na terenie Krakowa oraz z łąki w Bieszczadach, którym nadano oznaczenia S1, S2, S3 oraz S4. Biochemiczną analizę jakościową wykonano dzięki technikom spektroskopii: FT-RS oraz FT-IR. Wybrano dwa stanowiska: S1 oraz S3 i założono z nich kultury in vitro, wykorzystując organy roślin z osobników w populacji macierzystych jako eksplantaty. Oceniono intensywność kalusowania i zdolności morfogenetyczne dla eksplantatów-łodyg i eksplantatów-liści na trzech stałych podłożach hodowlanych z dodatkiem odpowiednio: TDZ, NAA + BAP oraz 2,4-D + KIN, w zależności od warunków świetlnych. Po uzyskaniu materiału w kulturach in vitro, wykonano pomiary FT-RS dla tkanki kalusowej, powstałych na niej pędów przybyszowych oraz roślin aklimatyzowanych, uwzględniając liście i łodygi.Dowiedziono, że oba rodzaje eksplantatów reagowały zdecydowanie najlepiej na medium MS z dodatkiem TDZ, początkowo łodygi w warunkach fotoperiodu (LD 16:8),a liście w całkowitej ciemności (DD). Na pożywce z dodatkiem 2,4-D + KIN zauważono indukcję niemorfogennej tkanki kalusowej, natomiast na medium z dodatkiem TDZ oraz NAA + BAP – morfogennej tkanki kalusowej. Przypuszczalnie wszystkie pędy przybyszowe powstawały w wyniku organogenezy pośredniej. Aby zwiększyć wzrost elongacyjny pędów przybyszowych, część kalusów pozbawiono wpływu TDZ i umieszczono je na medium ½ MS, na którym służyły jako źródło potrzebnych substancji dla nowo wyrastających pędów przybyszowych. Młode pędy udało się ukorzenić z zastosowaniem auksyny – IBA, po czym przeniesiono je do warunków ex vitro. Stwierdzono też różnice między wydajnością regeneracyjną eksplantatów-łodyg w zależności od populacji macierzystej oraz między zdolnościami morfogenetycznymi liści i łodyg. Podczas prowadzenia kultury obserwowano endogenne zakażenia eksplantatów. Zaproponowano też protokół regeneracyjny dla H. perforatum z wykorzystaniem dwóch rodzajów eksplantatów.W badaniach biochemicznych wykazano u dziurawca zmienność międzypopulacyjną w zawartości głównie karotenoidów i związków fenolowych oraz wyraźne różnice między organami, z których najlepiej prezentowały się liście, trochę gorzej łodygi, a pozostałe organy dawały mniej wyraźne sygnały w obrazie widm ramanowskich. Zauważono, że zarówno liście roślin dzikich, jak i regenerantów reprezentują najwyraźniejsze pasma FT-Ramana dla metabolitów wtórnych na każdym etapie doświadczenia. Między kulturami S1 i S3w warunkach in vitro oraz ex vitro utrzymywała się biochemiczna zmienność, w porównaniu z analizą środowiskową, na korzyść S3. Warunki in vitro wpłynęły znaczącona obniżenie syntezy zidentyfikowanych metabolitów, co było widoczne w postaci spadku intensywności sygnału od większości metabolitów wtórnych, co obserwowano u aklimatyzowanych roślin. Świeża tkanka kalusowa oraz łodygi roślin aklimatyzowanych nie były zadowalającym materiałem do analizy ramanowskiej, ale na pozostałe organy były bardzo dobrym surowcem do badań. Stwierdzono też, że światło wpływa zarówno na kierunek morfogenezy H. perforatum, jak obniża produkcję metabolitów wtórnych.

Hypericum perforatum L. is a well-known and valued plant due to its antibacterial, antifungal, anti-inflammatory, antioxidant and antidepressant properties. It has interesting secondary metabolites, including polyphenols, flavonoids, carotenoids and naphthodiantrons and it is the subject of many ecological and pharmacological studies. The aims of the study were: first of all, evaluation of the morphogenetic potential and obtaining an efficient regeneration system of this plant for application of different combinations of the plant growth and development regulators belonging to auxins and cytokinins. Moreover the purpose of the study was to compare chemical composition of the organs of St. John's wort, four wild populations, and examining the influence of in vitro and ex vitro conditions on the metabolic profile of this species.Plant raw material was collected from three different localisations in Krakow and from a meadow in the Bieszczady Mountains and called S1, S2, S3 and S4 site. Qualitative biochemical analysis was performed using spectroscopic techniques: FT-RS and FT-IR. S1 and S3 was selected and in vitro cultures were established from them, using plant organs from individuals from these populations as explants, callusing intensity and morphogenetic abilities for stem explants and leaf explants were assessed on three solid culture media with the addition of TDZ, NAA + BAP and 2,4-D + KIN, respectively, depending on the light conditions. After obtaining the material in in vitro cultures, FT-RS measurements were made for the callus tissue, the adventitious shoots formed on it and the acclimated plants, taking into account the leaves and stems.It was proved that both types of explants respond the best on MS medium with the addition of TDZ, initially the stem under photoperiod conditions LD 16: 8, and DD. Induction of non-morphogenic callus tissue was observed on the medium with the addition of 2,4-D + KIN, while on the medium with the addition of TDZ and NAA + BAP - morphogenic callus tissue. Presumably, all adventitious shoots were formed as a result of indirect organogenesis. In order to increase the elongation growth of adventitious shoots, some of the calli were stripped of the influence of TDZ and placed on the medium MS medium, where they served as a source of necessary substances for newly emerging adventitious shoots. Young shoots were rooted with the use of auxin - IBA, and then transferred to ex vitro conditions. Differences were also found between the regenerative efficiency of explants-stems depending on the parent population and between morphogenetic abilities of leaves and stems. Endogenous infections of explants were observed during culture cultivation. A regeneration protocol for H. preforatum using two types of explants was also proposed.Biochemical studies proved that St. John's wort the inter-population variability in the content of mainly carotenoids and phenolic compounds, as well as clear differences between the organs where the leaves were the best, the stems were slightly worse, and the remaining organs showed less distinct signals in the Raman spectra. It was noted that both wild and regenerant leaves represent the clearest FT-Raman bands for secondary metabolites at each stage of the experiment. Biochemical variation persisted between S1 and S3 cultures in vitro and ex vitro, compared to environmental analysis, in favor of S3. The in vitro conditions probably significantly reduced the synthesis of the identified metabolites, which was evident in the decrease of signal intensity from most secondary metabolites, which was observed in acclimatized plants. Fresh callus tissue and stems of acclimatized plants were not a satisfactory material for Raman analysis, but for the remaining organs they were a very good material for research. It was also found that light influences both the direction of H. perforatum morphogenesis and reduces the production of secondary metabolites.