Preparation of genetic constructs enabling expression of human protein YY2 with decreased number of zinc fingers

Celem pracy było zaprojektowanie i otrzymanie plazmidów zawierających gen kodujący ludzkie białko YY2 z 1, 2 i 3 palcami cynkowymi. Białko YY2 jest ludzkim czynnikiem transkrypcyjnym zawierającym motyw palców cynkowych. Plazmid zawierający gen kodujący YY2 namnożono w E. coli. Po ekstrakcji plazmidów użyto ich jako matryc do reakcji PCR, w których powielane były całe plazmidy zawierające gen kodujący YY2 z pominięciem wybranej liczby palców cynkowych. Startery zaprojektowano w taki sposób aby otaczały fragmenty kodujące palce cynkowe, dzięki czemu możliwe było usunięcie 1, 2 lub 3 palców cynkowych. Otrzymane w tych reakcjach konstrukty rozdzielono elektroforetycznie, a następnie wyizolowano z żelu. Końce 5’ liniowych produktów ufosforylowano, a następnie poddano ligacji tworząc koliste plazmidy. Tak uzyskanymi plazmidami transformowano kompetentne bakterie E. coli. Powodzenie transformacji sprawdzono poprzez posiew bakterii na podłoże selekcyjne zawierające ampicylinę. Jako dodatkową kontrolę wykorzystano PCR z kolonii. Elektroforeza produktów tej reakcji wskazywała na niepowodzenie transformacji, co było sprzecznie z wynikami posiewu selekcyjnego. Powtórzenie PCR z kolonii nie dało jednoznacznych wyników. Kontynuacja badań nie była możliwa ze względu na sytuację epidemiologiczną.

The aim of the work was to design and obtain plasmids containing the gene encoding human YY2 protein with 1, 2 and 3 zinc fingers. The YY2 protein is a human transcription factor containing a zinc finger motif. The plasmid containing the gene encoding YY2 was amplified in E. coli. After extraction of the plasmids, they were used as templates for PCR, in which whole plasmids containing the YY2 coding gene were amplified without the selected number of zinc fingers. The primers were designed to surround the zinc finger coding fragments, making it possible to remove 1, 2 or 3 zinc fingers. The constructs obtained in these reactions were electrophoretically separated and then isolated from the gel. The 5 ' ends of the linear products were phosphorylated and then ligated to form circular plasmids. Competent E. coli bacteria were transformed with the plasmids obtained in the previous step. The success of the transformation was checked by selective medium containing ampicillin. Colony PCR was used as an additional control. The electrophoresis of the products of this reaction indicated a failure of the transformation, which was contrary to the results of the selective medium growth. Repeating of colony PCR did not give conclusive results. Continuation of the study was not possible due to the epidemiological situation.