Inducible gene repression system in eukaryotic cells based on lactose operon components

Na rynku dostępnych jest wiele systemów umożliwiających kontrolę ekspresji genów, jednak nawet te najczęściej wykorzystywane jak systemy Tet-On i Tet-off, mają swoje ograniczenia. Do tej pory nie został opracowany system, który umożliwiałby kontrolę ekspresji dwóch różnych genów niezależnie od siebie, bądź dawał możliwość kontroli zarówno ekspresji, jak i represji danego genu. Celem pracy było opracowanie takiego systemu, opierając się na komponentach bakteryjnego operonu laktozowego oraz zmutowanej domenie wiążącej ligand pochodzącej z receptora estrogenowego (domena ERT2). W niniejszej pracy za pomocą metod inżynierii genetycznej utworzono konstrukt zawierający sekwencję kodującą białko fuzyjne składające się z domeny represora laktozowego, fluorescencyjnego białka mScarlet oraz domen ERT2. Wykonując transfekcję komórek HeLa zaprojektowanym plazmidem, wykazano ekspresję białka, które w całości znajdowało się w cytoplazmie. Indukcja tych komórek za pomocą 4-hydroksytamoksyfenu nie powodowała jednak importu białka fuzyjnego do jądra, co uniemożliwia poprawne działanie systemu.Rozwiązaniem tego problemu może okazać się wklonowanie do konstruktu dodatkowych sekwencji NLS lub usunięcie domeny mScarlet, która pełni wyłącznie funkcję reporterową. W przyszłości należałoby uzyskać wektor zawierający gen reporterowy poniżej sekwencji operatora laktozowego, który razem z zaprojektowanym wcześniej plazmidem tworzyłby system Lac-off umożliwiający kontrolowalną represję genów. Ostatecznie łącząc systemy Lac-Off i Tet-on uzyskalibyśmy system dający użytkownikom możliwość dokładniejszej kontroli ekspresji genów.

There are many systems allowing the gene expression control. Even the most popular ones like Tet-On and Tet-Off have their limitations, though. There is still no applicable system granting the possibility of controlling the expression of two genes independently, nor one allowing both expression and repression of a given gene. The aim of this study was to develop such a system utilizing the bacterial lactose operon and mutated ligand-binding domain of the estrogen receptor (ERT2 domain). The construct containing sequences of the lactose repressor, the fluorescent protein mScarlet and ERT2 domains was created by the means of the genetic engineering. After the transfection of HeLa cells with the obtained construct, the expression of the protein localized in the cytoplasm was shown. However, the induction with 4-hydroxytamoxifen of the formerly transfected HeLa cells did not cause the import of the fusion protein into the nucleus, preventing the designed system from working. This problem might probably be solved by adding NLS sequences to the construct or by removing the mScarlet domain, which only works as a reporter. In the future research an additional plasmid with the reporter gene downstream from the lactose operator should be constructed, which together with the already acquired vector would complete the Lac-off system. Finally combining both Lac-Off and Tet-On systems would offer more precise method of the gene expression control.