Flavobacterium psychrophilum to gram-ujemny pałeczkowiec wywołujący bakteryjną chorobę zimnych wód. Bakterie te atakują głównie ryby z rzędu łososiowatych, a jej wysoka śmiertelność, łatwość przenoszenia się, a także rosnąca oporność na stosowane antybiotyki powodują ogromne straty ekonomiczne. Wirulencja F. psychrophilum oparta jest na pozakomórkowej aktywności enzymatycznej, umożliwiającej pokonanie barier ochronnych i w następstwie kolonizację swojego żywiciela. F. psychrophilum wydziela enzymy wykorzystując system sekrecyjny typu IX (T9SS), którego budowa jest najlepiej poznana u bakterii Porphyromonas gingivalis. P. gingivalis należy do gram-ujemnych pałeczkowców, które są głównymi patogenami tkanek przyzębia u człowieka. Badania nad budową i funkcją systemu T9SS u P. gingivalis pozwoliły na odkrycie i opisanie dwóch kluczowych dla procesu sekrecji białek powierzchniowych – PorU oraz PorZ. PorU to sortaza, odpowiedzialna za odcinanie C-końcowej domeny (CTD) w wydzielanych poza komórkę białkach. PorU w przeciwieństwie do wydzielanych białek charakteryzuje się nienaruszoną domeną CTD. PorZ to białko niezbędne w procesie przenoszenia wydzielanych białek z peryplazmy poza komórkę, chociaż dokładna jego funkcja jest wciąż nieznana. Wiadomo jednak, że mutacja lub usunięcie domeny CTD białka PorZ wiąże się z utratą jego funkcjonalności, a tym samym upośledzenia wydzielania białek przez T9SS. Niedawne badania nad F. psychrophilum pozwoliły na odkrycie u tej bakterii genów ortologicznych do genów kodujących białka T9SS u P. gingivalis, w tym również sekwencji homologicznych do genów kodujących białka PorU oraz PorZ.Celem niniejszej pracy było opracowanie wydajnej procedury izolacji oraz oczyszczania rekombinowanych białek PorU oraz PorZ. Ze względu na to, że oczyszczane białka stanowią homologi dla białek P. gingivalis, wstępna procedura była oparta na protokole oczyszczania tych białek opracowanym w Zakładzie Mikrobiologii. Białka produkowano w bakterii Escherichia coli BL21. Uzyskane ze szczepu BL21 białko PorZ było zadowalającej czystości, jednak charakteryzowało się niską stabilnością i szybkim wytracaniem. Białko PorU natomiast było w znacznym stopniu zanieczyszczone, a ilość uzyskanego białka była niezadowalająca. W związku z tym, zdecydowano się na zmianę szczepu hodowlanego. W tym celu przeprowadzono test ekspresji obu białek w dwóch szczepach: Arctic oraz Rosetta. W teście ekspresji zbadano wpływ temperatury oraz stężenia czynnika indukującego na ilość oraz czystość wyprodukowanych białek w obu szczepach bakteryjnych. Uzyskane wyniki dla białka PorZ ujawniły korzystny wpływ niskiej temperatury, w której prowadzono produkcję białka na jego stabilność oraz końcową czystość. Określono również przewagę szczepu Arctic nad szczepem Rosetta w kwestii ilości wyprodukowanego białka. Oczyszczanie z użyciem metod chromatografii powinowactwa i sączenia molekularnego pozwoliło na uzyskanie wysokiej czystości białka PorZ. W przypadku białka PorU ponownie uzyskano wyższą ekspresję białka w szczepie Arctic. Podczas oczyszczania pojawił się jednak problem z usunięciem białka czaperonowego związanego z białkiem PorU. W celu jego usunięcia próbowano zastosować chromatografię powinowactwa, sączenie molekularne, dodatkowe płukanie kolumny w buforze zawierającym ATP i lizat zdenaturowanych białek bakteryjnych, a także chromatografię jonowymienną. Nie udało się jednak usunąć zanieczyszczenia białkiem czaperonowym. Uzyskanie białka o wysokiej czystości jest niezbędne do dalszych badań, między innymi nad strukturą krystalograficzną. W związku z tym, uzyskanie wydajnej procedury oczyszczania obu białek stanowi ważny etap dla badań nad skuteczną terapią przeciwko F. psychrophilum.

Flavobacterium psychrophilum is a gram-negative bacterial rod responsible for bacterial cold water disease. Said microorganism infects mainly fish from the family of Salmonidae, and its lethality, ease of spread, as well as growing resistance to currently used antibiotics cause significant economic losses. Virulence of F. psychrophilum is centred around extracellular enzymatic activity, which allows it to penetrate its host’s protective barriers and colonize the victim. F. psychrophilum secretes enzymes using type IX secretion system (T9SS), the structure of which is best described in Porphyromonas gingivalis. P. gingivalis is a gram-negative bacterial rod and is the main pathogen of periodontal tissues in humans. Research focused on the structure and function of T9SS has discovered and described two critical elements of protein secretion process, namely surface proteins PorU and PorZ. PorU is a sortase, responsible for cleaving C-terminal domain (CTD) of the secreted proteins. Structure of PorU protein stands out because of its untouched during expression and translocation CTD. PorZ is a protein required in the process of transporting secreted proteins from periplasm outside the cell. While its function at the moment remains unknown, it has been discovered that mutation or removal of PorZ CTD results in loss of functional protein, leading to a degraded performance of T9SS. Through recent research, genes orthologous to genes coding T9SS proteins in P. gingivalis have been found in the genome of F. psychrophilum. Further analysis has uncovered presence of sequences homologous to P. gingivalis proteins PorU and PorZ in F. psychrophilum.The purpose of this thesis was to develop an optimized protocol for recombinant protein PorU and PorZ isolation and purification. Since both proteins are homologous to P. gingivalis proteins, initial experiments were based on the protocol developed in Microbiology Faculty of Jagiellonian University. The proteins were produced in BL21 strain of Escherichia coli. Purity of protein PorZ obtained from BL21 strain was satisfactory, but the protein was unstable and precipitated easily. PorU protein was obtained in small amounts, and was heavily contaminated. Due to unsatisfactory results, a decision was made to change the bacterial strain used for protein production. Expression assay was performed for two strains, Arctic and Rosetta. During the assay, influence of three factors on the purity and amount of protein obtained was evaluated: temperature of protein induction and production, concentration of inducing agent, as well as performance of strain used. Acquired results have shown beneficial effects of low temperature used during protein induction and production. Arctic strain was also shown to have higher protein yield compared to Rosetta strain. Purification through affinity chromatography and size-exclusion chromatography has been successfully used to obtain high purity PorZ protein. As for PorU protein, higher expression level was obtained with Arctic strain. During further purification a problem arised concerning removal of chaperone protein bound to PorU protein. In order to remove the chaperone affinity chromatography, size-exclusion chromatography, additional column washing using buffer containing ATP and denaturated bacterial lysate, as well as ion exchange chromatography techniques were used. Used methods did not remove the chaperone, though. High purity protein is required, in order to study, among others, protein’s crystal structure. Due to that, developing efficient purification protocol for both proteins is an important step for research on new therapies against F. psychrophilum.