Funkcjonalna charakterystyka kinazy kazeinowej Hrr25 w regulacji kompleksu Elongatora

Wszystkie żywe organizmy wytwarzają różnego rodzaju białka, aby utrzymać stałą równowagę fizjologiczną i móc w ten sposób prawidłowo funkcjonować w otaczającym je świecie. Synteza białek musi być jednak ściśle kontrolowana przez liczne wewnątrzkomórkowe mechanizmy danego organizmu. Ważnym aspektem, aczkolwiek wcześniej słabo scharakteryzowanym, jest szybkość syntezy białek. Odpowiednie tempo translacji oraz mechanizmy z udziałem chaperonów umożliwiają białkom przyjęcie ich natywnej konformacji. Jednym z mechanizmów wpływających na szybkość syntezy białek jest proces modyfikacji tRNA przeprowadzany przez silnie konserwatywny kompleks Elongatora. Elongator jest dużym kompleksem białkowym odpowiedzialnym za proces modyfikacji U34 w pozycji chwiejnej antykodonu w 11 tRNA. Kompleks Elongatora składa się z sześciu par podjednostek (Elp1-6), które są niezbędne do zachowania jego prawidłowej aktywności enzymatycznej. Dodatkowo, kompleks ten można podzielić na dwa subkompleksy, Elp123 i Elp456. Subkompleks Elp123 tworzy katalityczny rdzeń kompleksu (Elp3), zaś subkompleks Elp456 – w postaci heksamerycznego pierścienia – prawdopodobnie bierze udział w procesie rekrutacji lub uwalniania tRNA. Oba subkompleksy współdziałają ze sobą w celu wprowadzenia grupy5-karboksymetylowej do urydyny U34 (cm5U34) w pozycji chwiejnej antykodonu tRNA. Aby kompleks Elongatora mógł prawidłowo funkcjonować, niezbędne są inne przejściowo związane z nim białka, tj. heterodimer Kti11/13, Kti12, fosfataza Sit4 oraz kinaza serynowo-treoninowa Hrr25. Białka te regulują aktywność Elongatora, przez co wpływają jednocześnie na różne tempo syntezy białek.W niniejszej pracy dokonano ekspresji białka Hrr25 oraz zbadano jego niektóre właściwości fizykochemiczne. Ponadto, przeanalizowano możliwe interakcje zachodzące pomiędzy białkami Hrr25, Kti12 oraz kompleksem Elongatora. W ten sposób określono dokładne miejsce oddziaływania Hrr25 z podjednostką Elp1. Wykazano, iż kinaza Hrr25 jest aktywna i zdolna do autofosforylacji oraz do fosforylacji poszczególnych regionów Elp1. Za pomocą spektrometrii mas zdefiniowano dokładne miejsca fosforylacji zarówno na Hrr25 jak i na podjednostce Elp1. Dodatkowo, wygenerowano szereg mutantów w celu zbadania mechanizmu autofosforylacji kinazy. Podjęto również próbę wyjaśnienia roli autofosforylacji kinazy w regulacji aktywności kompleksu Elongatora.

All living organisms produce different proteins to maintain physiological homeostasis and to be able to function appropriately in the world around them. Protein synthesis has to be strictly controlled by multiple intracellular mechanisms. An important variable, although previously less characterized, is the speed of translation. Proper translation speed, together with the chaperone machinery, make proteins adopt their native three-dimensional conformation. One of the mechanisms that affects translation speed relies on a tRNA modification at the wobble position, performed by the highly conserved Elongator complex.The Elongator is a large multiprotein complex responsible for wobble U34 modifications that occur in 11 tRNA species. The Elongator consists of six pairs of subunits (Elp1-6), which all are critical for its proper enzymatic activity. The Elongator complex is composed of two functional entities, the Elp123 subcomplex and the Elp456 ring. The Elp123 subcomplex harbours the catalytic core (Elp3) while the Elp456 hexameric ring possesses a helicase-like fold and is thought to participate in the process of tRNA binding or release. Elp123 and Elp456 work together to transfer a 5-carboxymethyl group to the uridine U34 (cm5U34) at the wobble position of anticodon stem and loop. To perform its function, the Elongator requires multiple transiently bound proteins, including heterodimer Kti11/Kti13, Kti12, Sit4 phosphatase, and serine-threonine kinase – Hrr25. Altogether, they regulate Elongator complex activity, which results in different translation rates. In this research project, we expressed Hrr25 protein and studied some of its physicochemical properties. We explored possible interaction networks between Hrr25, Kti12 and the Elp1 subunit of the Elongator complex and mapped the exact binding site of Hrr25 on the Elp1 protein. We demonstrated that the Hrr25 kinase is active and can phosphorylate itself and particular residues of the Elp1 subunit. In collaboration with the mass spectrometry core facility, we were able to determine precise phosphorylation sites both on Elp1 as well as on Hrr25. Additionally, we generated several point mutants to investigate the mechanistic details of autophosphorylation. Finally, we attempt to explain the role of kinase autophosphorylation in the regulation of the whole Elongator complex.