Obtaining doxycycline-inducible deletion of Zc3h12a gene in mouse embryonic fibroblasts by using Cre-loxP recombination and Tet-on system

System Cre-lox jest wykorzystywany w genetyce molekularnej jako narzędzie do delecji specyficznego genu zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Mechanizm jego działania opiera się na wprowadzeniu sekwencji loxP w miejscach, które mają ulec delecji w wyniku działania rekombinazy Cre. Indukowalność delecji genu jest możliwa, dzięki zastosowaniu systemu Tet-on. W obecności doksycykliny zachodzi jego aktywacja, co umożliwia przyłączenie się czynnika transkrypcyjnego rtTA do promotora TetO i tym samym ekspresje białka Cre.Gen Zc3h12a jest odpowiedzialny za kodowanie białka MCPIP1, które uczestniczy w ważnych procesach fizjologicznych, takich jak regulacja stanu zapalnego, czy adipogeneza. Celem naszego projektu było uzyskanie konstruktu genetycznego, który umożliwi delecję genu kodującego białko MCPIP1 w modelu in vitro mysich embrionalnych fibroblastów, wyizolowanych z embrionów transgenicznej myszy Zc3h12alox/lox, indukowaną doksycykliną w systemie Tet-on. Konstrukt genetyczny został przygotowany przy wykorzystaniu techniki klonowania molekularnego. Przy użyciu trawienia enzymatycznego, wycięto gen kodujący białko Cre z plazmidu pIRESpuro Rosa 26 Cre ERT2 i wklonowano go do wektora przejściowego pENTR2B. Następnie przy użyciu systemu Gateway LR Clonase II, przeprowadzono rekombinację in vitro pomiędzy wektorem przejściowym (zawierającym gen kodujący białko Cre otoczony elementami attL) i wektorem docelowym pCW57.1 (zawierającym miejsca attR) w celu wytworzenia wektora ekspresyjnego pCW57.1-CRE. W kolejnym etapie namnożono cząsteczki lentiwirusowe, transfekując linię komórkową HEK293, plazmidem pCW57.1-CRE, oraz plazmidami pomocniczymi psPAX2 i pMD2. W celu potwierdzenia działania zaprojektowanego przez nas konstruktu, mysie embrionalne fibroblasty, mające gen Zc3h12a otoczony sekwencjami loxP, transdukowano wektorami lentiwirusowymi kodującymi gen dla białka Cre oraz wektorem kontrolnym, nieniosącym żadnej sekwencji. Lizaty białkowe zebrane z obu linii poddano analizie Western blot z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko MCPIP1.

Cre-lox system is being commonly used as a tool in molecular genetics to gene-specific deletion both in vitro and in vivo. Its mechanism is based on flanking the gene of interest with loxP sequence, which will be deleted, as a result of Cre recombinase activity. Inducibility of deletion is possible due to the Tet-on system. In the presence of doxycycline, it is activated, which enables interaction of transcription factor rtTA with TetO promoter resulting in Cre protein expression. Zc3h12a gene is responsible for encoding MCPIP1 protein, which contributes to important physiological processes like regulation of inflammation or adipogenesis. The main goal of this project was obtaining a genetic construct, which enables doxycycline-inducible deletion of Zc3h12a gene in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from transgenic mouse Zc3h12alox/lox within Tet-on system The molecular cloning was used in creating a genetic construct. Using restriction digest, the gene encoding Cre protein was cut from pIRESpuro Rosa 26 Cre ERT2 and inserted into pENTR2B vector plasmid. Then with Gateway LR Clonase II system, the recombination was performed between pENTR2B (containing Cre insert flanked with attL sequences) and pCW57.1 which was a destination vector (containing attR sites). This procedure was crucial for obtaining ready pCW57.1-CRE vector. Next stage was production of lentiviral vectors, by transfection of HEK293 cell line with pCW57.1 vector, and packaging plasmids: psPAX2 and pMD2. To confirm whether our genetic construct is functional, mouse embryonic fibroblasts containing Zc3h12a gene flanked with loxP sequences were transduced with lentiviral vectors with Cre insert and negative vector without any insert. Protein lysates from both cell lines have been collected and analyzed with Western Blotting technique using anti-MCPIP1 antibody.