Activation effect on selected neutrophils' functions - low density neutrophils population analysis

Granulocyty obojętnochłonne są komórkami żernymi pełniącymi kluczową rolę w początkowych stadiach odpowiedzi immunologicznej. Ich działanie opiera się o trzy mechanizmy: fagocytozę, degranulację, oraz NETozę. NEToza jest rodzajem śmierci komórkowej, podczas której neutrofil wyrzuca ze swojego wnętrza chromatynę dekorowaną białkami, aby proces ten mógł zajść niezbędna jest elastaza – enzym z ziarnistości pierwszorzędowych komórek.Wykazano, że we krwi osób cierpiących na choroby autoimmunizacyjne, autozapalne oraz zapalne znajduje się subpopulacja neutrofili niskiej gęstości (LDG), która w czasie wirowania komórek z krwi w gradiencie gęstości lokuje się we frakcji komórek jednojądrzastych. Przypuszcza się, że ich obecność może mieć związek z rozwojem i postępem choroby. W związku z ograniczoną dostępnością materiału od pacjentów, pomocą w lepszym poznaniu tej populacji komórek byłoby znalezienie dla niej modelu badawczego. W tym celu postanowiono sprawdzić, czy neutrofile aktywowane N formylowanymi peptydami (fMLP) pochodzenia bakteryjnego posiadają takie same cechy, jak LDG obserwowane u pacjentów. W niniejszej pracy magisterskiej, korzystając z metod fluorymetrycznych, immunofluorescencyjnych oraz analiz kinetycznych, zbadano właściwości fizyko-chemiczne i funkcje tych komórek. Stwierdzono, że zmiany dostępności epitopów elastazy nie są tak znaczące, jak w komórkach LDG. Co ciekawe, zmiana immunoreaktywności wobec SLPI, po aktywacji PMN i zmianie ich gęstości, odpowiada fenotypowi obserwowanemu dla LDG. Komórki preaktywowane fMLP są dodatkowo skłonne do spontanicznej NETozy. Ostatecznie stwierdzono, że prektywacja fMLP wywołuje zmiany gęstości komórek i zmiany fenotypu podobne dla opisywanych dla LDG. Pomimo tego, obserwowane różnice sugerujące, że mogą stanowić odrębną subpopulację komórek, uniemożliwiają wykorzystanie ich jako łatwo dostępnego, uniwersalnego modelu do badań populacji LDG.

Neutrophils are phagocytes that play a crucial role during initial stages of the immune response. They use three main mechanisms: phagocytosis, degranulation, and NETosis. NETosis is a cell death type, that depends on ejecting chromatin decorated with proteins out of the cell. The process of NETosis requires an elastase, which is a serine protease stored in azurophilic granules. It is also proved that a neutrophil subpopulation called low density granulocytes can be found in autoimmune patient’s blood. Presumably LDG (low density neutrophils) relate to development of autoimmune diseases. There is a need to find the LDG’s cell model. The object of this study was to determine if neutrophils activated by N formylated peptides from bacteria would present the same characteristics as LDG obtained from patient blood. In this thesis, physical and chemical properties of this cells were analyzed. Experiments were conducted relying on immunofluorescence, fluorimetry and kinetic analysis. Here were shown the alterations in the availability of epitopes of elastase. However, the changes of epitopes’ availability are not as significant as in patients’ LDG. Observed changes of immunoreactivity against SLPI are similar to those observed in LDG. Additionally, cells preactivated by fMLP are prone to spontaneous NETosis. In conclusion; neutrophil activation induced by fMLP leads to the decrease of cell density, that are in line with changes observed in low density neutrophil population obtained from patient blood. Nevertheless, observed differences suggest that they may constitute a separate subpopulation of cells, what make them impossible to use as an easily accessible, universal model for studying the LDG population.