Initial estimation of the number and duration of endogenous XRCC1 protein foci in the HeLa cell nucleus

Istnieją różne źródła uszkodzeń DNA. Są to np. promieniowanie jonizujące, promieniowanie UV oraz reaktywne formy tlenu. Skutkiem ich działania może być kilka rodzajów uszkodzeń DNA, m.in powstawanie miejsc apurynowych/apirymidynowych, tworzenie dimerów tymidynowych. Jako następstwa tych uszkodzeń mogą powstać pojedyncze pęknięcia DNA (SSB) lub podwójne pęknięcia DNA (DSB). Komórki eukariotyczne posiadają odpowiednie mechanizmy odpowiadające za naprawę uszkodzeń. SSB mogą być naprawiane na drodze SSBR, któa jest uznawana za szczególny rodzaj mechanizmu Base Excision Repair (BER). Za naprawę DSB odpowiada mechanim Microhomology-mediated End Joining (MMEJ). W obu tych mechanizmach bierze udział białko XRCC1, które pełni rolę rusztowania oraz rekrutuje inne czynniki białkowe. W związku z tym XRCC1 może pełnić rolę markera pęknięć DNA. Podjęto próbę oszacowania liczby endogennych pęknięć DNA w jądrach komórek linii HeLa, nie traktowanych czynnikami uszkadzającymi, na podstawie liczby skupisk XRCC1 z metką fluorescencyjną eGFP. Warunki eksperymentu wymagały kilkumiesięcznej optymalizacji, po której uzyskano wstępne szacunkowe wyniki - liczbę skupisk XRCC1 w jądrze HeLa pojawiających się w ciągu doby. Założono, że odpowiadają one liczbie endogennych pęknięć DNA. Wyniki te różnią się znacznie od dostępnych danych literaturowych.

There are various sources of DNA damage. These are, for example, ionizing radiation, UV radiation and reactive oxygen species. The effect of their action may be several types of DNA damage, e.g. formation of aponyne / apirimidine sites, thymidine dimer formation. As a consequence of these lesions, single DNA ruptures (SSBs) or double DNA ruptures (DSBs) can arise. Eukaryotic cells have appropriate mechanisms for repairing damage. SSB can be repaired by SSBR, which is considered a special type of Base Excision Repair (BER). For repair, DSB responds with the mechanism of Microhomology-mediated End Joining (MMEJ). In both mechanisms, the XRCC1 protein takes part, which acts as a scaffold and recruits other protein factors. Therefore, XRCC1 may act as a DNA break marker. An attempt was made to estimate the number of endogenous DNA breaks in the HeLa cell nuclei, not treated with damaging factors, based on the number of clusters of XRCC1 with the eGFP fluorescent label. The conditions of the experiment required several months of optimization, after which initial results were obtained - the number of XRCC1 clusters in the HeLa nucleus appearing throughout the day. It was assumed that they correspond to the number of endogenous DNA breaks. These results differ significantly from the available literature data.