Optimization of expression and purification of recombinant MCPIP4 protein from E.coli BL21 strain

Najlepiej poznanym przedstawicielem nowo poznanej rodziny białek MCPIP jest MCPIP1. Jest ono RNazą o selektywnym działaniu destabilizującym mRNA czynników, które związane są z odpowiedzią immunologiczną. Pełni istotną rolę w negatywnej regulacji stanu zapalnego oraz zachowaniu homeostazy organizmu. MCPIP1 posiada wiele domen funkcjonalnych, których współdziałanie warunkuje pełną aktywność białka. MCPIP4 należy do tej samej rodziny białek co MCPIP1. Mimo udowodnionej funkcji w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, dokładny mechanizm jego działania wciąż jest zagadką. Bliższe poznanie właściwości i funkcji białek wymaga pozyskania ich w formie natywnej. Najpopularniejszym sposobem produkcji białek jest ich biosynteza w prokariotycznych systemach ekspresyjnych. Wynika to z szerokiego wyboru szczepów bakterii oraz możliwość uzyskania dużych ilości białka w krótkim czasie. Najczęściej wykorzystywaną metodą pozyskiwania białka z hodowli bakteryjnej jest chromatografia powinowactwa. Opiera się ona na wykorzystaniu specjalnych znaczników obecnych w sekwencji rekombinowanego białka, które umożliwiają jego adsorpcje na złożach zawierających określone biologiczne lub chemiczne ligandy. W niniejszej pracy opisano optymalizację ekspresji białka MCPIP4 w bakteryjnym systemie ekspresyjnym oraz próbę jego oczyszczenia, wykorzystując obecność metki His-tag obecnej na N-końcu białka oraz metki Strep-tag II na C-końcu. Dzięki dwustopniowej chromatografii powinowactwa możliwe jest pozyskanie białka pełnej długości.W wyniku przeprowadzonych doświadczeń wybrano optymalne warunki do wzrostu hodowli bakteryjnej, uwzględniając takie czynniki jak rodzaj stosowanego medium hodowlanego, temperatura oraz długość prowadzenia hodowli. Wybrano także bardziej wydajny sposób lizy komórek bakteryjnych. W trakcie optymalizacji procesu oczyszczania białka MCPIP4 zmodyfikowano metkę, otrzymując TwinStrep składający się z dwóch metek Strep-tag II oraz łącznika. Dzięki tej modyfikacji uzyskano wyższe powinowactwo rekombinowanego białka do złoża. Wprowadzono do procesu złoże trzeciej generacji – StrepTaktynę XT oraz zmodyfikowano skład buforu płuczącego kolumnę, zapewniającą najwyższą wydajność oczyszczania. Wykazano lepszą jakoś oczyszczania rekombinowanego białka na złożu kobaltowym w porównaniu z niklowym. Zwiększano ponadto skalę hodowli w celu uzyskania wystarczającej ilości produktu oraz podjęto próbę zwiększenia wydajności ekspresji białka poprzez wykorzystanie rzadkich kodonów.Wprowadzone modyfikacje pozwoliły otrzymać oczyszczone białko MCPIP4 i przeprowadzić test in vitro wykazujący jego aktywność RNazową. Otrzymane wyniki wskazywały na aktywność biologiczną pozyskanego białka, jednak proces wymaga dalszej optymalizacji.

The best studied representative of novel MCPIP protein family is MCPIP1. It is the RNase with selective destabilizing effect on mRNAs of particles responsible for immune response. It plays an important role in the negative regulation of inflammation and maintaining the homeostasis. MCPIP1 has many functional domains, which interactions determines the full activity of the protein. MCPIP4 belongs to the same protein family as MCPIP1. Despite the proven function in the course of the immune response, the exact mechanism of its functioning is still not clear.A closer understanding of the properties and functions of proteins requires obtaining them in their native form. The most popular method of protein production is their biosynthesis in prokaryotic expression systems. It is due to the wide selection of strains and the possibility of obtaining large amounts of protein in a short time.The most commonly used method of obtaining protein from a bacterial culture is the affinity chromatography. It is based on the use of special tags present in the recombinant protein sequence that enable its adsorption on beds containing specific biological or chemical ligands.This thesis describes the optimization of the expression of the MCPIP4 protein in the bacterial expression system and the attempt to purify it, using the presence of the His-tag present at the N-terminus of the protein and the Strep-tag II at the C-terminus. Such strategy allows to obtain full-length protein as a result of two-step chromatography.Due to conducted experiments, the optimal conditions for the growth of the bacterial culture were selected, taking into account, such factors as, the type of culturing medium used, temperature and length of the culture. A more efficient method for lysing bacterial cells was also selected.During the optimization of the MCPIP4 protein purification process, the tag was modified to obtain a TwinStrep tag consisting of two Strep-tag II tags and a linker, showing higher affinity to the resin. A third-generation bed was introduced into the process - StrepTactynXT and modification of the composition of the washing buffer, ensuring the highest purification efficiency. The cobalt purification was more efficient than nickel purification in obtaining better quality of purified recombinant MCPIP4. The bacterial culture scale was increased to obtain a sufficient amount of a product. An attempt was made to increase the efficiency of protein expression by using rare codons.The introduced modifications allowed for an in vitro test demonstrating RNase activity of MCPIP4. The results indicate that the obtained protein is biological active, however the process requires further optimization.