Investigation of toxicity determinants of PemKSa1 toxin from the PemIKSa1 toxin-antitoxin system of Staphylococcus aureus using site-directed mutagenesis

Systemy toksyna-antytoksyna (TA) to układy, które zostały zidentyfikowane u bakterii zarówno w plazmidowym jak i chromosomalnym DNA. W zależności od rodzaju a także aktywności antytoksyny wyróżnia się sześć typów tych systemów. Najszerzej poznane układy należą do typu II, w którym to białkowe antytoksyny neutralizują swoje toksyny. Przykładem systemu TA typu II jest gronkowcowy układ PemIKSa1. Został on po raz pierwszy zidentyfikowany na plazmidzie pCH91 w szczepie Staphylococcus aureus CH91. Za pomocą analiz bioinformatycznych zidentyfikowano układy PemIK także w wielu innych gatunkach bakterii z rodzaju Staphyloccocus jak np. S. delphini, których to toksyna PemKSd wykazuje znikomą toksyczność, co odróżnia ją od wcześniej scharakteryzowanej toksyny S. aureus. Celem pracy było zweryfikowanie 11 wytypowanych determinant toksyczności toksyny PemKSa1 z układu toksyna-antytoksyna PemIKSa1 bakterii S. aureus. Determinanty toksyczności zostały wytypowane w wyniku porównania dwóch toksyn, które skrajnie różnią się toksycznością: PemKSa1 i PemKSd. Badania zaczęto od przeprowadzenia mutagenezy ukierunkowanej, mającej na celu wprowadzenie kodonów wytypowanych odpowiedników do sekwencji toksyny PemKSa1 na podstawie sekwencji toksyny PemKSd. W celu weryfikacji toksyczności zmutowanych toksyn wykonano testy ekspresji, a następnie porównując poziomy ekspresji zmutowanych toksyn z oryginalnym PemKSa1, wnioskowano o wzroście lub obniżeniu toksyczności. Aby potwierdzić uzyskany wynik podczas testów ekspresji, wykonano obserwację hamowania wzrostu oraz pomiary kinetyki wzrostu rekombinowanych szczepów E. coli BL21 (DE3). W wyniku wykonanych testów wytypowano jedną resztę, która odpowiada za toksyczność toksyny PemKSa1 – D80. Na koniec wykonano mutagenezę ukierunkowaną w odwrotnym kierunku tj. wprowadzono wymienioną resztę (D80) do sekwencji toksyny PemKSd na podstawie sekwencji toksyny PemKSa1. Dla tej zmiany również zostały przeprowadzone testy weryfikacji toksyczności wymienione wyżej, które potwierdziły, że reszta D80 w toksynie S. aureus odpowiada za jej toksyczność.

Toxin-antitoxin systems (TA) are systems that has been identified in bacteria in both plasmid and chromosomal DNA. Depending on the type and the antitoxin activity, currently there are six types of these systems. The most widely known systems belong to the type II, in which protein antitoxins neutralize their toxins. An example of a TA type II system is the staphylococcal PemIKSa1 system. It was first identified on the pCH91 plasmid in the poultry strain S. aureus CH91. By means of bioinformatic analyzes, PemIK systems have also been identified in many other Staphyloccocus species, such as S. delphini, whose toxin exhibits negligible toxicity and this is significantly different from the previously characterized Staphylococcus aureus toxin.The aim of this work was to verify 11 selected putative toxicity determinants of PemKSa1 toxin from the PemIKSa1 toxin-antitoxin system of S. aureus. Determinants of toxicity were selected based on a sequence comparison of two toxins, which are extremely different in toxicity: PemKSa1 and PemKSd. The studies began with a site-directed mutagenesis aimed at introducing codons of designated counterparts to the PemKSa1 toxin sequence based on the PemKSd toxin sequence. In order to verify the toxicity of the mutant toxins, the expression tests were performed. Then comparing the expression levels of the mutant toxins with the original PemKSa1, it was possible to conclude that the toxicity increased or decreased. To confirm the obtained result during the expression tests, the observation of growth inhibition and the measurements of the growth kinetics of the recombinant strains E. coli BL21 (DE3) were performed. As a result of the tests, one residue could be identified which is responsible for the toxicity of the PemKSa1 – D80 toxin. Finally, site-ditected mutagenesis was performed in the reverse direction, i.e. the mentioned residue (D80) was introduced into the PemKSd toxin sequence based on the PemKSa1 toxin sequence. For this change, the toxicity verification tests mentioned above have also been carried out, which confirmed that the rest of D80 in S. aureus toxin is responsible for its toxicity.