Generation of HeLa cell line with the Tet-Off inducible gene expression system and functional analysis of prepared line

Tet-Off to eukariotyczny system indukowalnej ekspresji genów – umożliwia wyłączanie transkrypcji w obecności tetracykliny lub jej pochodnych jak doksycyklina. System ten oparty jest na dwóch wektorach: pierwszy zawiera gen kodujący tTA (tetracycline-controlled transactivator), czyli transaktywator kontrolowany tetracykliną. Białko to powstało w wyniku fuzji bakteryjnego represora tetracyklinowego TetR oraz domeny aktywującej transkrypcję, pochodzącej z białka VP16. Drugi wektor zawiera sekwencję TRE (tetracycline-response element) złożoną z kilku powtórzeń bakteryjnej sekwencji operatorowej TetO i minimalnego promotora P CMV. Pod jej kontrolą znajduje się badany gen. W wyniku przyłączenia transaktywtora tTA do sekwencji TRE dochodzi do ekspresji genu znajdującego się pod kontrolą TRE. Ekspresja zostaje zahamowana po dodaniu doksycykliny do układu – wiąże się ona z tTA, który traci powinowactwo do TRE. Jednym z głównych zastosowań systemu Tet-Off jest badanie czasu półtrwania transkryptów, a także badanie funkcji białek.Celem pracy było wyprowadzenie linii komórkowej HeLa z systemem Tet-Off na drodze stabilnej transfekcji uliniowionym plazmidem pTet-Off Advanced (kodujący zmodyfikowany transaktywator tTA-Advanced oraz gen oporności na neomycynę), selekcji za pomocą antybiotyku G418, klonowania oraz analizy funkcjonalnej wyprowadzonych klonów. W wyniku selekcji i klonowania otrzymano 18 klonów opornych na antybiotyk. Analizę funkcjonalną przeprowadzono z wykorzystaniem przejściowej transfekcji plazmidem pTRE-Tight-Luc (kodujący lucyferazę firefly, umieszczoną pod kontrolą sekwencji TRE) oraz pomiarów aktywności lucyferazy. Ekspresję lucyferazy próbowano wyciszyć przez dodatek doksycykliny do pożywki, w celu znalezienia klonów o najwyższym stopniu wyciszenia ekspresji.

Tet-Off is an eukaryotic system of inducible gene expression. It allows to turn the transcription off in the presence of tetracycline and its derivatives like doxycycline. This system is based on two vectors. The first one encodes tetracycline-controlled transactivator (tTA) fusion protein. tTA consists of bacterial tetracycline repressor (TetR) and transcription-activating domain of VP16 protein. The second one codes for tetracycline-response element (TRE) which is comprised of severally repeated bacterial operator sequence (TetO) and P CMV minimal promoter. Gene of interest is placed under the control of TRE sequence. Its expression is turned on in the wake of tTA binding to TRE sequence. Expression is limited after addition of doxycycline. Doxycycline binds to tTA and lowers its affinity for TRE sequence. Study of transcript half-life and investigating the function of proteins are main applications of Tet-Off system.Generation of HeLa Tet-Off cell line was the aim of this study. The procedure was made up of stable transfection by linearized pTet-Off Advanced plasmid (which encodes tTA-Advanced modified transactivator and neomycin resistance gene), selection by G418 antibiotic, cloning and functional analysis of generated clones. Eighteen antibiotic resistant clones were obtained as a result of selection and cloning. Functional analysis was conducted by transient transfection of pTRE-Tight-Luc plasmid (encoding firefly luciferase under control of TRE) and luciferase activity assay. The expression of luciferase was suppressed by the addition of doxycycline to the culture medium in order to assign the clones with the highest factor of expression silencing.