Internalization of HCoV-NL63 to LLC-Mk2 cells

Koronawirusy są opłaszczonymi wirusami o genomie w formie jednoniciowego RNA. Stanowią bardzo zróżnicowaną pod względem patogenności oraz specyficzności gatunkowej grupę wirusów. Ludzkie koronawirusy powodują głównie zakażenia dróg oddechowych o różnym nasileniu, począwszy od przeziębienia po zespoły SARS oraz MERS. Wyizolowany w 2003 roku ludzki koronawirus NL63 powoduje infekcje o łagodnym przebiegu, zakażając komórki nabłonka ludzkich płuc. Dobrym modelem do badania procesu infekcji wirusem HCoV-NL63 na poziomie komórkowym okazała się być linia komórkowa LLC-Mk2, wyprowadzona z komórek nabłonka małpiej nerki.Celem pracy była identyfikacja procesu endocytozy HCoV-NL63 do komórek LLC-Mk2. Zostały wykonane pomiary kolokalizacji wirusa z wybranymi markerami różnych ścieżek endocytozy z użyciem mikroskopii konfokalnej oraz technik analizy obrazu. Sprawdzono również wpływ inhibitorów endocytozy na wejście wirusa do komórki oraz na jego replikację. Zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej dSTORM pozwoliło na wizualizację pojedynczych cząstek wirusowych we wczesnych endosomach.Ustalono, że podczas internalizacji wirus HCoV-NL63 korzysta ze ścieżki klatrynozależnej. Wejście wirusa do komórki zależne jest od polimeryzacji klatryny, aktywności dynaminy oraz obniżenia pH w pęcherzykach. Inhibitory drogi klatrynozależnej wydajnie hamują zarówno wejście wirusa do komórki, jak i jego replikację.Implementacja metod biofizycznych, tj. mikroskopii wysoko- i superrozdzielczej oraz zaawansowanej analizy obrazu, do dziedziny wirusologii jest szansą na zrozumienie procesów leżących u podstaw mechanizmu zakażenia wirusowego. Wykorzystane techniki zapewniają szczegółowy wgląd w niepoznane dotąd procesy. Szczegółowe poznanie charakteru interakcji wirus-komórka umożliwia nie tylko lepsze zrozumienie procesu zakażenia, ale w przyszłości pozwoli na zaproponowanie odpowiedniego podejścia terapeutycznego i profilaktycznego.

Coronaviruses are enveloped single stranded RNA viruses. They are very diverse in terms of pathogenicity and species specificity group of viruses. Human coronaviruses cause primarily infections of respiratory tract, varying from common cold to severe diseases, such as SARS and MERS syndromes. Isolated in 2003, human coronavirus NL63 causes mild infections by infecting epithelium of conductive airways and lungs. A good model to study an infection process of HCoV-NL63 on the cell level is the LLC-Mk2 cell line, derived from monkey kidney epithelium.The aim of the study was to identify the route of HCoV-NL63 endocytosis to LLC-Mk2 cells. Measurements of co-localization of viral particles with certain markers of endocytic pathways were performed using confocal microscopy and image analysis techniques. The effect of endocytosis inhibitors on viral entry and replication was also examined. The use of supperresolution dSTORM microscopy allowed for visualization of single viral particles in early endosomes.In the study it was determined that HCoV-NL63 employs clathrin-dependent pathway during infectious entry. Virus internalization depends on clathrin polymerization, dynamin activity and pH decrease in endocytic vesicles. Clathrin inhibitors prevent both entry and replication of the virus.The implementation of biophysical methods, i.e., high- and superresolution microscopy and advanced image analysis methods, to virology enables us to understand the processes underlying viral infection. Detailed knowledge on the virus-cell interactions allows not only for better understanding of the infection process, but in the future may lead to development of novel therapeutic and prophylactic strategies.