Qualitative analysis of neutrophil extracellular traps

Neutrofile stanowią najliczniejszą grupę leukocytów krwi obwodowej u człowieka. Są komórkami uczestniczącymi w odporności wrodzonej, dlatego też ich głównym zadaniem jest ochrona organizmu przed różnego rodzaju drobnoustrojami. Nie bez powodu pojawiają się jako pierwsze w miejscu infekcji, gdzie w odpowiedzi na patogen uruchamiają szereg działań obronnych takich jak: fagocytoza, mechanizmy bójcze zależne oraz niezależne od reaktywnych form tlenu czy produkcję neutrofilowych sieci zewnątrzkomórkowych (NETs). Proces formowania sieci został poznany stosunkowo niedawno, bo dopiero w 2004 roku, jednak obecnie jest silnie eksplorowany przez wiele grup badawczych. NETs są strukturami składającymi się z DNA stanowiącego rusztowanie oraz kationowych białek, które na zasadzie oddziaływania elektrostatycznego wiążą się z ujemnie naładowanym kwasem nukleinowym. Sieci chronią przed drobnoustrojami w dwojaki sposób, stanowią one zarówno przeszkodę fizyczną, w której unieruchamiają mikroorganizmy, tym samym zapobiegając ich rozprzestrzenianiu się w organizmie, ale również poprzez szeroką gamę dodatnio naładowanych białek działają bakteriobójczo jak i bakteriostatycznie. Mechanizm formowania sieci nie jest dokładnie znany, jednak powszechnie zakłada się, że angażuje on błonowy kompleks oksydazy NADPH, skutkiem czego jest produkcja reaktywnych form tlenu. Dodatkowym elementem jest proces proteolitycznej degradacji histonów lub cytrulinacji histonu H3 przez enzym PAD4, co w obu przypadkach skutkuje rozluźnieniem struktury nukelosomu. Wyniki ostatnich badań sugerują występowanie różnych mechanizmów molekularnych, które są zależne od stymulacji neutrofili, np. przy pomocy PMA lub jonoforu A23187 (kalcymycyna). Odmienne szlaki aktywacji nasuwają pytania odnośnie różnic w składzie białkowym sieci powstałych po aktywacji PMN przy pomocy różnych czynników. W niniejszej pracy starano się ocenić w sposób jakościowy neutrofilowe sieci zewnątrzkomórkowe w kontekście występowania na ich powierzchni elastazy, jej inhibitora SLPI oraz cytrulinowanego histonu H3.

Neutrophils are the most abundant group of leukocytes in human peripheral blood. Since they are involved in innate immunity, their main role is to protect us from different microorganisms. Neutrophils are first cells to appear in the site of inflammation, where in response to pathogen they are performing a number of actions like: phagocytosis, killing mechanisms dependent and independent from reactive oxygen species and also formation of neutrophil extracellular traps (NETs).The process of NETs formation wasn’t known until 2004, but currently it is widely explored among many research groups. NETs are structures containing DNA, which acts like a scaffold for cationic proteins, which are bound to negatively charged chromatin via electrostatic interactions. NETs are protecting against microbes in two ways: they are physical barrier, in which they are immobilizing pathogens and preventing them from spreading further, but also through wide range of positively charged proteins, which act bacteriostatic and antibacterial.Mechanism of NETs formation is not fully understood, but it was shown, that membrane complex of NADPH-oxidase is involved, leading to the production of reactive oxygen species. Additional step is the proteolysis of histone or process of histone H3 citrullination through PAD4 enzyme, what results in relaxation of nucleosome structure. In the light of recent studies it is postulated that different neutrophils stimulants (i.e. PMA or A23187) can trigger NETosis by diverse molecular mechanisms.Aim of this thesis, was to analyze qualitatively neutrophil extracellular traps in terms of occurrence of elastase, its inhibitor SLPI and citrullinated histone H3.