Immunohistochemical imaging changes in the distribution of zinc transporters ZnT-1 and ZnT-3 in the hippocampus of rats with zinc deficiency and after amitriptyline treatment

Depresja jest jedną z najczęstszych chorób psychicznych, jednak jej etiologia nie została w pełni wyjaśniona. Do badania przyczyn depresji i zaburzeń jej towarzyszących służą zwierzęce modele depresji, do których należy model deficytu cynku wykorzystany w niniejszej pracy. Homeostaza cynku odgrywa kluczową rolę dla prawidłowego funkcjonowania układu nerwowego i jest utrzymywana przez białka z rodziny Zip i ZnT, w tym transportery cynku ZnT1 i ZnT3. Wyniki badań wskazują na udział tego pierwiastka w patofizjologii zaburzeń depresyjnych.Celem pracy było zbadanie zmian immunoekspresji białek transportujących cynk ZnT1 i ZnT3 w hipokampie dorsalnym szczura, w warunkach depresji indukowanej przez deficyt cynku i pod wpływem leczenia amitryptyliną.Materiał badawczy wykorzystany w niniejszej pracy stanowiły mózgi pochodzące od szczurów rasy Sprague-Dawley. Zwierzęta podzielono na 4 grupy badawcze: kontrolną bez deficytu cynku (ZnA), deficytową (ZnD), grupę z deficytem cynku, u której stosowano amitryptylinę (ZnD+AMI) oraz grupę bez deficytu, której podawano amitryptylinę (ZnA+AMI). Preparaty tkanki mózgowej poddano procedurze immunohistochemicznej LSAB, w której użyto króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko ZnT1 i mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ZnT3. Następnie z użyciem mikroskopu i komputerowego systemu do analizy obrazu wyznaczono wskaźnik gęstości optycznej obszarów hipokampa wykazujących ekspresję białka ZnT1 i ZnT3. Uzyskane wyniki przeanalizowano w programie Statistica 10, wykorzystując test ANOVA Kruskala-Wallisa, test t-Studenta i korelację Pearsona. Ekspresja ZnT1 w formacji hipomapa jest powszechna i w miarę jednolita. Białko to skupione jest głównie w błonach synaptycznych. W modelu deficytu cynku ekspresja ZnT1 uległa osłabieniu w grupie ZnD względem ZnA, w warstwie promienistej pól CA3 (p<0,01) i CA1 (p<0,001). Test t-Studenta nie wykazał istotnych statystycznie różnic między lewym i prawym hipokampem. Zastosowanie amitryptyliny pogłębiło zmiany wywołane niedoborem cynku; w grupie ZnA+AMI względem ZnA zanotowano istotny statystycznie spadek immunoreaktywności, największy w warstwie promienistej pól CA3 (p=0,0000) i CA1 (p<0,01).Ekspresja ZnT3 w hipokampie jest bardzo zróżnicowana. Najsilniejszą reaktywność stwierdzono w warstwie włókien mszystych i wnęce zakrętu zębatego, gdzie stężenie synaptycznego cynku jest największe. W modelu deficytu cynku zaobserwowano wzrost immunoreaktywności ZnT3 w grupie ZnD względem ZnA, w niemal wszystkich analizowanych obszarach hipokampa poza wnęką zakrętu zębatego. Najbardziej istotny wzrost ekspresji dotyczył środkowej warstwy molekularnej zakrętu zębatego (p=0,0000) oraz warstwy promienistej pól CA3 (p<0,01) i CA1 (p<0,001). Zastosowanie amitryptyliny nie wywołało istotnych statystycznie zmian ekspresji. Test t-Studenta nie wykazał różnic między lewym i prawym hipokampem.Można przypuszczać, że zarówno spadek immunoreaktywności ZnT1, jak i wzrost immunoreaktywności ZnT3 mają pełnić rolę protekcyjną w obliczu niewielkiej dostępności cynku (zapobiegać jego nadmiernej utracie). Zróżnicowany wzorzec immunoekspresji ZnT1 i ZnT3 w formacji hipokampa oraz odmienny charakter zmian obserwowanych w modelu deficytu cynku wskazują, że transportery te pełnią różne, niezależne od siebie role w patofizjologii zaburzeń depresyjnych.

Depression is one of the most common mental illnesses but its etiology is not fully understood. To study the causes of depression and its associated disorders the animal models of depression are used, including zinc deficiency model used in this study. Zinc homeostasis plays a key role in the smooth functioning of the nervous system and is maintained by the family of proteins Zip and ZnT. The test results indicate a role for zinc in the pathophysiology of depression.The aim of the study was to examine changes in the expression of zinc transporter proteins ZnT1 and ZnT3 in the dorsal hippocampus of the rat, in the zinc deficiency model of depression and under the influence of amitriptyline treatment.As a research material in this study, brains derived from Sprague-Dawley rats were used. The animals were divided into 4 experimental groups: control group (ZnA), group with zinc deficiency (ZnD), group with zinc deficiency receiving amitriptyline (ZnD+AMI) and group with no deficit receiving amitriptyline (ZnA+AMI). The preparations of the brain tissue were subjected to the immunohistochemical LSAB procedure, in which rabbit polyclonal antibodies against ZnT1 and mouse monoclonal antibodies against ZnT3 were used. Subsequently, using microscope and image analyzing computer system, the optical density ratio of areas of the hippocampus displaying expression of ZnT1 and ZnT3 proteins was determined. The results were analyzed in the Statistica 10 programme using the Kruskal-Wallis ANOVA test, t-Student test and the Pearson correlation.Expression of ZnT1 in hippocampal formation is common and homogenous. This protein is concentrated mainly in synaptic membranes. In the zinc deficiency model expression of ZnT1 was weakened in group ZnD in comparison with group ZnA, in the stratum radiatum layer of CA3 (p<0,01) and CA1 (p<0,001) fields. t-Student test showed no statistically significant differences between the left and right hippocampus. The use of amitriptyline deepened changes caused by deficiency of zinc; there was statistically significant decrease in immunoreactivity in group ZnA+AMI in comparison with group ZnA, the greatest in the stratum radiatum layer of CA3 (p=0,0000) and CA1 (p<0,01) fields.ZnT3 expression in the hippocampus is very diverse. The strongest reactivity was found in the mossy fiber layer and the hilum of the dentate gyrus, where the concentration of synaptic zinc is the greatest. In zinc deficiency model an increase in immunoreactivity of ZnT3 in group ZnD in comparison with ZnA, in almost all analyzed areas (except the hilum of the dentate gyrus) of the hippocampus was observed. The most significant increase in expression concerned the middle molecular layer of the dentate gyrus (p=0,0000) and the stratum radiatum layer of the CA3 (p<0,01) and CA1 (p <0,001) fields. The use of amitriptyline did not produce statistically significant changes in expression. t-Student test showed no differences between the left and right hippocampus.It can be assumed that both decreased ZnT1 immunoreactivity and increased ZnT3 immunoreactivity are to play a protective role in the face of low availability of zinc (to prevent the excessive loss). Diverse pattern of ZnT1 and ZnT3 expression in the hippocampus and the different nature of the changes observed in the zinc deficiency model indicate that these transporters play a different, independent role in the pathophysiology of depression.