CorA z Thermatoga maritima to pentameryczny kanał jonowy odpowiedzialny za homeostazę jonów magnezu w komórce. Nietypowa budowa kanału, z dużą, N-końcową domeną cytoplazmatyczną oraz domeną C-końcową tworzącą por, jest silnie zakonserwowana wśród prokariotów. Struktura zamkniętego stanu kanału CorA została rozwiązana w 2005 roku, natomiast struktura konformacji otwartej, zdolnej do przewodzenia jonów nadal pozostaje nieznana. Niniejsza praca opisuje próbę rozwiązana struktury otwartego stanu CorA z zastosowaniem konformacyjnie specyficznych, syntetycznych fragmentów przeciwciał jako czaperonów krystalizacji. Fragmenty przeciwciał uzyskano z wykorzystaniem nowatorskiej metody opartej o ekspresję fagową, która wykorzystuje nanodyski jako nośniki białek membranowych.CorA wprowadzono do biotynylowanych nanodysków o średnicy ok. 8 nm. Tak uzyskane struktury białkowo-lipidowe wiążą się na złożu opłaszczonym streptawidyną, a ich elucja możliwa jest z użyciem detergentu. Po 5 rundach selekcji przeanalizowano 96 klonów pod kątem specyficznego wiązania do CorA w nanodyskach. Ich sekwencjonowanie ujawniło obecność 27 unikalnych fragmentów przeciwciał, które następnie zostały wyekspresjonowane i oczyszczone. Wszystkie oczyszczone przeciwciała specyficznie wiążą CorA w detergencie oraz większość z nich wykazuje wiązanie zależne od jonów magnezu, co świadczy o ich specyficzności konformacyjnej. Uzyskane przeciwciała tworzą stabilne kompleksy z CorA, a część również z rozpuszczalną domeną N-terminalną. Ich zastosowanie jako czaperonów krystalizacji pozwala na uzyskanie nowych morfologii kryształów, które po optymalizacji mogą zostać użyte do analizy dyfrakcji promieniowania X.Dzięki ekspresji fagowej uzyskano panel potencjalnych czaperonów krystalizacji, przy czym wiele z nich wiąże się tylko do wybranych konformacji CorA. Zastosowanie przeciwciał usprawnia krystalizację, a uzyskane kryształy mogą potencjalnie dostarczyć informacji strukturalnych o otwartej konformacji kanału CorA.

CorA from Thermatoga maritima is a pentameric divalent ion channel responsible for magnesium homeostasis. Its unusual topology, with a bulky and highly charged cytoplasmic domain and pore-forming C-terminus, is well conserved among prokaryotes. While the structure of the closed state of the channel was solved in 2005, the structure of the open, conductive state still remains elusive. This study presents an attempt to resolve the structure of the open state of CorA using conformation-specific, synthetic antibody fragments (sABs) generated using a novel, phage display protocol in NDs as crystallization chaperones.CorA is incorporated into biotinylated, lipid filled nanodiscs that are 8 nm in diameter. It was shown that CorA in NDs is efficiently captured onto and released from the streptavidin-coated solid surface. After five rounds of biopanning, 96 clones were investigated for binding towards CorA with phage ELISA. Sequence analysis of positive clones revealed 27 unique sABs that bind to CorA with high specificity. The unique sABs were then cloned into expression vectors, expressed in E.coli and purified. All purified sABs retained their binding towards CorA in detergent, and the majority of the generated sABs show magnesium-dependent binding, which confirms their conformation-specificity. The generated sABs form stable complexes with full length CorA and CorA N-terminal domain. Application of sABs as crystallization chaperones facilitate formation of crystals of new, unique morphologies.Phage display selection allowed generation of a panel of potential crystallization chaperones, many of which are conformation-specific. The generated sABs were shown to facilitate crystallization of CorA. Acquired crystals can therefore be used for X-ray diffraction analysis and can potentially allow us to resolve the structure of CorA in the open, conductive conformation.