Expression pattern of SOMATIC EMBRIOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE (SERK) gene in petioles of Trifolium nigrescens (Viv.) cultured in vitro.

Celem pracy było sprawdzenie ekspresji kinazy receptoropodobnej SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE) w kulturze in vitro ogonków liściowych Trifolium nigrescens. Analizę ekspresji genu przeprowadzono metodą łańcuchowej reakcji polimerazy z użyciem odwrotnej transkryptazy. Analizy molekularne uzupełniono badaniami histologicznymi eksplantatów z różnych pożywek. Materiał do badań stanowiły eksplantaty ogonów liściowych (o długości 0.5 cm) uzyskane z młodych roślin (5 cm wysokości). W celu indukcji ryzogenezy eksplantaty umieszczano na pożywce MS (Murashige i Skoog, 1962) uzupełnionej auksyną: kwasem naftylo-1-octowym (NAA) w stężeniu 1 mg/l. Po 3 tygodniach ryzogeneza zachodziła na 70% eksplantatów. Ogonki wszczepiano również na pożywkę nieryzogeniczną, tj. MS z dodatkiem 0.1 mg/l NAA oraz 2 mg/l cytokininy: 2-izopentyloadeniny (2iP), na której obserwowano wzrost nieregenerującego kalusa. W celu sprawdzenia wpływu stresu oksydacyjnego na ekspresję SERK ogonki liściowe wykładano na pożywkę ryzogeniczną uzupełnioną przeciwutleniaczem, kwasem askorbinowym (ASA) w stężeniach: 1 μM, 10 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 5 mM lub 10 mM. W porównaniu do pożywki ryzogenicznej, w kulturach z ASA obserwowano obniżenie częstości ryzogenezy w zakresie 10-30 p. p. w zależności od użytego stężenia przeciwutleniacza. ASA użyty w stężeniach milimolowych powodował obumieranie eksplantatów.Analiza molekularna wykazała ekspresję genu SERK w eksplantatach przed wyłożeniem na pożywkę oraz w kalusach ryzogenicznych i nieryzogenicznych w 2 tygodniu kultury. W 4 tygodniu kultury ekspresji badanego genu nie stwierdzono zarówno w kalusach ryzogenicznych jak i nieregenerujących. Ekspresji genu SERK nie wykryto również w kulturach eksplantatów umieszczonych na pożywkach z dodatkiem ASA. Na podstawie badań histologicznych stwierdzono, że merystematyczne centra ryzogeniczne obecne były tylko na pożywce uzupełnionej NAA. Przeciwnie, w eksplantatach nieryzogenicznych stwierdzono występowanie licznych centrów waskularyzacji, z których w dalszej kolejności powstawały elementy przewodzące ksylemu. Uzyskane wyniki sugerują, że badany gen SERK u T. nigrescens zaangażowany jest różne procesy rozwojowe, m.in w ryzogenezę i ksylogenezę oraz w reakcje adaptacyjne do warunków stresu abiotycznego związanego z kulturą in vitro.

The aim of the study was to analyse the expression pattern of SOMATIC EMBRYGENSIS RECEPTOR-LIKE KINASE in in vitro culture of Trifolium nigrescens petioles. Gene expression was analysed using reverse transcription polymerase chain reaction. Molecular studies were supplemented with histological observations of on explants maintained under different in vitro conditions. Petiole segments (ca. 0.5 cm in length) were cut off from young plants (ca. 5 cm in height) and put onto MS medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented either with 1 mg/l 1-naphthylacetic acid (NAA) or with 0.1 mg/l NAA together with 2 mg/l cytokinin, 2-isopentyl adenine (2iP). After 4 weeks of culture on medium with NAA alone about 70% explants produced rhizogenic callus, whilst non-rhizogenic callus was formed on medium with NAA and 2iP. In order to test the involvement of SERK in stress response, the explants were maintained on media containing NAA and antioxidant, ascorbic acid (ASA) at 1 μM, 10 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 5 mM or 10 mM. Addition of ASA within a range of 1-200 μM brought about dose-dependent reduction in rhizogenesis (10 - 30 p. p. when compared with medium without ASA) whilst highest concentrations of ASA (5 and 10 mM) resulted in explant death.SERK expression was confirmed in explants before explantation as well as in rhizogenic and non-regenerative calluses by 2 weeks of culture. Prolonged culture up to the 4th week led to repression of a gene. This was also the case for explants maintained on media with ASA. Histological studies revealed that meristematic tissue from which the roots were initiated occurred exclusively in the callus cultured on medium with NAA alone. In contrast, the callus maintained on medium supplemented with NAA and cytokinin never produced rhizogenic centers but were abundant with xylogenic nodules. The obtained results suggest the possible involvement of SERK in different developmental events, including rhizogenesis and xylogenesis and also in adaptive response to abiotic stress associated with tissue culture of T. nigrescens.