Characterization of human neuroblastoma cells with MCPIP1 overexpression

Neuroblastoma (nbl) jest najczęściej występującym guzem litym wieku dziecięcego. Rozwija się z embrionalnych komórek części współczulnej układu autonomicznego. Obraz kliniczny zależy od wieku rozpoznania, stopnia zaawansowania choroby oraz cech biologicznych guza – w szczególności liczby kopii genu MYCN. Badania zostały wykonane na komórkach nbl ludzkiej linii BE(2)-C charakteryzujących się znaczną amplifikacją genu MYCN oraz wysoką tumorogennością. Po transfekcji tych komórek wektorem zapewniającym nadekspresję białka MCPIP1 zaobserwowano spadek potencjału proliferacyjnego oraz zmiany morfologii.Celem przedstawionej pracy było scharakteryzowanie klonów komórek linii neuroblastoma BE(2)-C, które wykazywały przejściową nadekspresję dzikiej formy białka MCPIP1 lub jego mutanta, pozbawionego domeny PIN (RNazowej), otrzymanych za pomocą transfekcji wektorem plazmidowym. Analiza badanych komórek obejmowała ocenę poziomu uzyskanej nadekspresji białka MCPIP1, a także analizę zmian poziomu onkogenu MYCN, wybranych transporterów substancji odżywczych oraz markerów apoptozy i różnicowania komórek nerwowych. Zmiany ekspresji genów zostały oznaczone z zastosowaniem PCR oraz PCR w czasie rzeczywistym, zaś zmiany poziomu poszczególnych białek zmierzono za pomocą analizy western blot.Przeprowadzone badania pozwoliły potwierdzić skuteczność i wydajność transfekcji wektorami plazmidowymi zawierającymi kasetę ekspresyjną dla dzikiej bądź zmutowanej formy białka MCPIP1. Wykazano również spadek ekspresji onkogenu MYCN w komórkach neuroblastoma pod wpływem nadekspresji dzikiej formy MCPIP1 na poziomie transkryptu oraz białka. Zaobserwowano także spadek ekspresji błonowego transportera choliny, CTL1, oraz inhibitora różnicowania komórek nerwowych, genu ID2, w komórkach wykazujących nadekspresję zarówno dzikiej jak i zmutowanej formy białka, co prawdopodobnie stanowi molekularną podstawę zmiany ich morfologii i spadku potencjału proliferacyjnego. Na podstawie analizy zmian poziomu markera apoptozy, białka PARP, stwierdzono że badane komórki nie są kierowane na drogę programowanej śmierci.

Neuroblastoma (nbl) is the most common extracranial solid tumour of childhood. It arises from embryonic cells of the autonomic nervous system. Present study has been performed on human BE(2)-C cells that are characterised by significant amplification of the MYCN oncogene and high tumorigenicity. A medical sign is highly variable and dependent on e.g. clinical stage or histolopathological features of tumour tissue – particularly on MYCN amplification. Temporary overexpression of MCPIP1 protein was elicited in the above-mentioned cells. Significant decrease in proliferation of BE(2)-C cells and morphological changes were observed in conditions of MCPIP1 overexpression.The aim of this study was to characterize neuroblastoma BE(2)-C cells which exhibit transient overexpression of the MCPIP1 protein wild form or its mutated form, without PIN domain, obtained by transfection with plasmid vectors. The analysis of the cells included valuation of MCPIP1 overexpression and valuation of changes in expression of MYCN oncogene, selected membrane nutrient transporters as well as markers of apoptosis and neural cells differentiation. Relative gene expression was checked by PCR or real time PCR and changes in protein levels were measured by western blot analysis.The studies allowed to confirm effectiveness and efficiency of transfection with plasmid vectors, which contained expression cassette for wild type MCPIP1 or for mutated form of MCPIP1. The experiments showed the decrease of MYCN oncogene expression in cells overexpressing wild type form of MCPIP1 protein, at both mRNA and protein level. Downregulation of transmembrane choline transporter, CTL1, and differentiation inhibitor, ID2 gene, were also observed under the conditions of overexpression of wild type or mutated MCPIP1, which is probably a molecular basis of proliferation inhibition and changes in morphology of studied cells. The analysis of changes in levels of apoptosis marker, PARP protein, strongly indicate that neuroblastoma cells with MCPIP1 overexpression don’t undergo programmed cell death.