Analysis of Fatty Acid Metabolism in Malignant Melanoma Cells Treated with PPARalpha Agonists

Celem prezentowanej pracy było sprawdzenie czy rozprzęgnięcie metabolizmu właściwego nowotworom jest w stanie zaindukować kryzys energetyczny, a w konsekwencji i śmierć komórek guza. Przeprowadzono analizę skuteczności i sposobu działania terapii opartej na indukcji PPARalfa w stosunku do trzech linii komórkowych czerniaka złośliwego: ludzkich WM115 i WM266.4 wyizolowanych od tego samego pacjenta odpowiednio z guza pierwotnego i jego przerzutu oraz mysiej B16F10. Testowano następujące ligandy PPARalfa: naturalne kwasy omega-3 PUFA (EPA i DHA) oraz syntetyczny lek na hiperlipidemię (fenofibrat). Hipoteza badawcza zakładała, że poprzez zewnętrzne wprowadzenie agonistów PPAR można zintensyfikować zawiadywane przez niego procesy i ścieżki sygnalizacyjne czyli przełączyć metabolizm z glikolizy w kierunku spalania kwasów tłuszczowych i w ten sposób zaindukować kryzys energetyczny w odznaczających się słabą plastycznością metaboliczną komórkach nowotworowych. Oceniono konsumpcję kwasów tłuszczowych oraz równoczesną produkcję ciał ketonowych. Sprawdzono również poziom enzymów mających duże znaczenie w gospodarce lipidowej (HMGCS, ACC, AMPK, Sirt1, ACAD9, ACADVL), a także oceniono aktywność ACADVL. Wszystkie badane ligandy wykazały właściwości antyneoplastyczne, obniżające tempo proliferacji komórek czerniaka, jednakże prawdopodobnie tylko częściowo odpowiada za nie aktywacja PPARalfa. Ogólnie kwasy omega-3 nie wywołały istotnych zmian w badanych komponentach metabolizmu tłuszczów. Nie przyczyniły się również do wzrostu natężenia procesu beta-oksydacji czy ketogenezy. Oczekiwane rezultaty związane z aktywacją PPARα uzyskano natomiast traktując komórki fenofibratem, który w znacznym stopniu przyczynił się do wzmożenia konsumpcji kwasów tłuszczowych jak i tworzenia ciał ketonowych. Zaobserwowano także wzrost fosforylacji AMPK oraz dezaktywację ACC w próbkach poddanych jego działaniu, w szczególności linii WM115. W tej linii także fenofibrat przyczynił się do zaniku enzymu ACAD9. Poza tym zanotowano znaczne różnice pomiędzy liniami WM115 i WM266.4, co wskazuje że proces złośliwienia zmienia profil białkowy i mechanizmy odpowiedzi na stres komórkowy.Odmienne reakcje WM115 i WM266.4 oraz sprzeczne dane literaturowe sugerują znaczne skomplikowanie procesów uruchamianych przez badane ligandy. Terapia agonistami PPARalfa nie wydaje się więc uniwersalnym lekiem, ale jej znaczna skuteczność w niektórych przypadkach potwierdza zasadność dalszych badań i daje nadzieję na poprawę rokowań pacjentów chorych na złośliwego czerniaka skóry.

In 1924 Otto Warburg formulated the hypothesis which assumed that the cause of cancer lies in disorders of mitochondrial function and in the redirection of energy management to obtain energy from the reaction of glycolysis. Today, after many years, this conviction is gaining support in the scientific community. The present work fits into this recently popular research trend. It tries to answer the following question, whether the uncoupling of metabolism typical for cancer is able to induce an energy crisis, and consequently a death of tumor cells. The ideal goal of therapy based on this belief seems to be PPARα, recognized as a key transcription factor responsible for a regulation of cell energetics. Its physiological function is to switch metabolism from the glucose utilization on the use of fatty acids and the production of an energy in the process of aerobic respiration. This study was designed to examine the effectiveness and the mechanism of action of the therapy based on an induction of PPARα for the three melanoma cell lines: murine B16F10, human WM115 and WM266.4 isolated from the same patient, respectively from the primary tumor and its metastasis. Among tested PPARα ligands were natural acids ω-3 PUFA: EPA and DHA, and the synthetic drug used in the treatment of hyperlipidemia, fenofibrate. Research hypothesis assumed that by external introducing of PPARα agonists, the processes and signaling pathways regulated by PPARα may be intensified, ie. to redirect the metabolism from glycolysis towards the burning of fatty acids, as it is considered that cancer cells can not do it efficiently and thereby induce energy crisis in characterized by poor metabolic plasticity tumor cells. The study was focused on the aspect of lipid metabolism. For this purpose the fatty acid consumption and the simultaneous production of ketone bodies were evaluated. Also the levels of enzymes which are of great importance in the metabolism of lipids: HMGCS, ACC, AMPK, SIRT1, ACAD9, ACADVL and the activity of ACADVL were tested. All tested ligands showed anti-neoplastic properties, reducing the rate of proliferation of melanoma cells, but the activation of PPARα is probably only partially responsible for that effect. Generally ω-3 fatty acids did not induce significant changes in the studied components of lipid metabolism. They also did not contribute to an increase in the intensity of the process of β-oxidation and ketogenesis. The expected results were obtained while treating the cells with fenofibrate, which greatly increased their consumption of fatty acids and the formation of ketone bodies. There was also observed an increase of phosphorylation of AMPK and ACC inactivation in the treated samples, in particular in the WM115 cells. In this cell line fenofibrate also contributed to the loss of ACAD9 enzyme. In addition, significant differences were noted between the lines WM115 and WM266.4, which shows how the process of malignant transformation change the protein profile as well as mechanisms for cellular stress response. Different reactions of WM115 and WM266.4 cell lines, conflicting literature and often unexpected results suggest considerable complexity of processes started by the tested ligands, what leads to the assumption that induced observable changes depend on many internal and external factors. PPARα agonist therapy does not seem to be a universal drug, but its significant effectiveness in some cases confirms the legitimacy of further research and gives hope for improvement of the prognosis for patients with malignant skin melanoma.