Evaluation of cytotoxic effect of butylated hydroxytoluene in vitro conditions

Butylohydroksytoluen jest jednym z najpopularniejszych przeciwutleniaczy z grupy syntetycznych fenoli. Substancja ta jest powszechnie wykorzystywana w przemyśle spożywczym i kosmetycznym, chemicznym i farmaceutycznym. Ze względu na to, że składnik ten jest szeroko stosowany w wielu produktach, może wnikać do organizmu różnymi drogami. BHT może więc być absorbowany zarówno przez układ pokarmowy, skórę jak i wziewnie [Leclerq, i wsp., 2000].Z jednej strony w kilku pracach wykazano kancerogenne działanie BHT u gryzoni, z drugiej jednak w niektórych badaniach stwierdzono, że BHT, przy podawaniu w wysokich dawkach, hamuje rakotwórcze efekty różnych kancerogenów w wielu tkankach myszy i szczurów. Podobnie w dotychczasowych badaniach dotyczących potencjalnego cytotoksycznego działania tego związku, wykazano zarówno jego ochronne działanie na wywołane stresem oksydacyjnym uszkodzenia komórek wątroby jak i nasilanie związanej ze stresem oksydacyjnym peroksydacji lipidów w komórkach serca. BHT jako związek lipofilny może przechodzić przez barierą krew-mózg i wpływać również na komórki centralnego systemu nerwowego (CSN) a dotychczas takie jego działanie nie zostało poznane [Tryphonas i wsp., 1999; Witschi i wsp., 1977; Lindenschmidt, 1986; Maeura i wsp., 1984; Imaida i wsp., 1984; Iqbal i wsp., 1995]. Celem niniejszej pracy była ocena potencjalnego, cytotoksycznego działania BHT na żywotność komórek nerwowych w warunkach in vitro. Komórki neuroblastomy ludzkiej, linii SH-SY5Y, hodowano w obecności butylohydroksytoluenu w zakresie stężeń 10-6 , 10-5, 10-4, 10-3 M przez 24 godziny i 72 godziny. Badano także wpływ BHT na wywoływane dodatkiem nadtlenku wodoru (0,5 mM) uszkodzenia komórek. Po upływie określonego czasu oceniono żywotność komórek za pomocą testu redukcji MTT i odsetek martwych komórek poprzez oznaczenie aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) uwolnionej z uszkodzonych komórek do pożywki hodowlanej .Wykazano, że butylohydroksytoluen w żadnym z badanych stężeń obecny w medium przez 24 godziny nie wpływał na uwalnianie LDH ani redukcję MTT. Natomiast we wszystkich zastosowanych stężeniach BHT obecny w hodowli przez 72 godziny nasilał żywotność komórek SH-SY5Y – obniżając aktywność LDH a zwiększając redukcję MTT. W badaniu wpływu butylohydroksytoluenu na wywoływane nadtlenkiem wodoru (model stresu oksydacyjnego) uszkodzenia neuronów wykazano, że związek ten we wszystkich zastosowanych stężeniach statystycznie znamiennie osłabiał niekorzystne działanie H2O2 na żywotność komórek. Butylohydroksytoluen obecny w pożywce hodowlanej przez 72 godziny, w powyżej opisanych stężeniach, wykazuje działanie neuroprotekcyjne zarówno na komórki hodowane w warunkach podstawowych jak i uszkadzanych przez nadtlenek wodoru. Uzyskane wyniki należy jednak interpretować ostrożnie, gdyż nie można wykluczyć, że długotrwałe narażenie na badany związek in vitro oraz in vivo, czy też że zastosowanie jego wyższych stężeń może zadziałać cytotoksycznie.

Butylated hydroxytoluene is one of the most common synthetic antioxidants, from the group of synthetic phenols. This substance is widely used in food, cosmetic, chemical and pharmaceutical industries. Due to the fact that this component is widely used in many products, it can penetrate the organism by different routes. BHT can therefore be absorbed by both the gastrointestinal tract, skin and by inhalation [Leclerq, i wsp., 2000]. On the one hand, several studies have shown carcinogenic activity of BHT in rodents, on the other hand, however, some studies have found that BHT, when administered at high doses, inhibits the carcinogenic effects of various carcinogens in multiple tissues in mice and rats. Similarly, the present studies of potential cytotoxic effects of the compound, shown both its protective effect on oxidative stress induced damage to the liver cells and enhancing the oxidative stress associated with lipid peroxidation in cells of the heart. BHT as a lipophilic compound can pass through the blood-brain barrier and also affect cells of the central nervous system (CSN) the effect, which up to the present study had not been studied [Tryphonas i wsp., 1999; Witschi i wsp., 1977; Lindenschmidt, 1986; Maeura i wsp., 1984; Imaida i wsp., 1984; Iqbal i wsp., 1995].The aim of this study was to evaluate the potential, cytotoxic effect of BHT on the viability of neuronal cells in in vitro conditions.Human neuroblastoma cells of SH-SY5Y line were grown in the presence of butylated hydroxytoluene in a concentration range of 10-6 , 10-5, 10-4, 10-3 µg/ml for 24 and 72 hours. The influence of BHT on the hydrogen peroxide-induced (0.5 mM) cell damage was also studied. After the specified time, cell viability was assessed using the MTT reduction assay and the percentage of dead cells was determined by lactate dehydrogenase (LDH) released from the damaged cells into the culture medium. It was demonstrated that in none of the tested concentrations butylated hydroxytoluene present in the medium for 24 hours had no effect on LDH release or reduction of MTT. However, in all the concentrations, BHT enhanced the viability of SH-SY5Y cells - lowering the activity of LDH and increasing the activity of MTT reduction.In a study of the induced BHT with hydrogen peroxide induced (oxidative stress model) neuronal injury has been shown that this compound in all concentrations statistically significantly attenuated adverse effect of H2O2 on cell viability. Butylated hydroxytoluene present in the culture medium for 72 hours, in the mentioned above concentrations shows neuroprotective activity both in cultured cells under basal conditions and damaged by H2O2. The results obtained should be interpreted with caution as it is possible that prolonged exposure to the test compound in vitro and in vivo, or the use of its higher concentrations can act cytotoxically.