Determination of organ clearance using isolated perfused rat liver model and a drug with a high hepatic extraction ratio as an example

W niniejszej pracy wyznaczono klirens wątrobowy oraz współczynnik ekstrakcji wątrobowej (ER) werapamilu, jako leku modelowego charakteryzującego się wysokim współczynnikiem ekstrakcji wątrobowej. Opracowano również i częściowo zwalidowano metodę analityczną oznaczania werapamilu i norwerapamilu w buforze KHB stanowiącym medium perfuzyjne. Próbki oczyszczano metodą deproteinizacji acetonitrylem. Oznaczenia ilościowe prowadzono stosując technikę LC/MS/MS. Rozdział prowadzono w warunkach gradientu składu faz (acetonitryl:woda) na kolumnie chromatograficznej XBridge C18 5 µm, 3x50mm przy szybkości przepływu 300 µL/min. W celu poprawy jonizacji zastosowano dodatek 0.1% kwasu mrówkowego. Opracowana metoda charakteryzowała się zadawalającą precyzją i dokładnością wyznaczoną zarówno w jednym jak i różnych dniach. Wartości współczynnika zmienności wahały się pomiędzy 0.22-6.33% w jednym dniu, oraz 0.12-5.83% w różnych dniach, a dokładności pomiędzy 95.2-114.2% w jednym dniu i 90.3-103.75% w różnych dniach dla obu oznaczanych związków. Opracowana metoda analityczna została wykorzystana do wyznaczenia ER werapamilu z zastosowaniem modelu izolowanej perfundowanej wątroby szczura (IPRL) dwoma metodami perfuzji, "single pass" i "recirculation". Wyznaczony metodą jednokrotnego przepływu klirens wątrobowy werapamilu wynosił 1.56±0.11 mL/min/gwątroby, natomiast ER 90.3±8.35%, co odpowiada danym literaturowym (92.5-95.8%), w przypadku zastosowania metody z recyrkulacją medium, obliczony klirens wątrobowy wynosił 1.5±0.1 mL/min/gwątroby natomiast ER był równy 84±9.47%. Przyczyną niższych wartości ER otrzymanych metodą "recirculation" może być wzrastające w miarę trwania perfuzji stężenie metabolitu w medium perfundującym, co z kolei mogło mieć wpływ na kinetykę metabolizmu związku macierzystego. W eksperymentach prowadzonych techniką „single pass” nie osiągnięto stanu równowagi, co może być wynikiem silnego wiązania się badanego leku z tkanką wątrobową. Za potwierdzeniem tej hipotezy przemawia duża wartość objętości dystrybucji werapamilu w wątrobie wynosząca 43±16.9 mL/gtkanki. Technika IPRL nadaje się do wyznaczania klirensu wątrobowego i niezależnie od stosowanej metody perfuzji "single pass" lub "recirculation" w przypadku leku modelowego jakim był werapamil otrzymane wartości współczynnika ekstrakcji wątrobowej są zbliżone do wartości literaturowych.

In this work,the hepatic clearance and hepatic extraction ratio (ER) of verapamil is determined as a model drug with a high hepatic extraction ratio. In additionan analytical method for the determination of verapamil and norverapamil in KHB buffer constituting the medium perfusion has been developed and partially validated. Samples were purified by deproteinization with acetonitrile. Quantification was carried out using the technique LC/MS/MS. Separation was performed under the conditions of the composition of phase gradient (acetonitrile:water) on the chromatography column XBridge C18 5 µm, 3x50mm at a flow rate of 300 mL/min. In order to improve ionization 0.1% formic acid was additivated. The method developed is characterized by satisfactory precision and accuracy determined over both single and mutliple days. The coefficient values of variation ranged from 0.22-6.33% over one day, and 0.12-5.83% over multiple days, and the level of accuracy from 95.2-114.2% overone day and 90.3-103.75% over multiple days for the two marked compounds. The analytical method developed was used to determine the ER of verapamil, using the model of isolated perfused rat liver (IPRL) in two methods of perfusion, "single pass" and "recirculation". The hepatic clearance of verapamil defined by a single pass was 1.56 ± 0.11 ml/min/gliver, while ER was 90.3 ± 8.35%, which corresponds to data found in literature (92.5-95.8%). In the case of the method with a recirculating medium, the calculated hepatic clearance was 1.5 ± 0.1 ml/min/gliver while ER was equal to 84 ± 9.47%. The reason for the lower value of ER obtained using "recirculation" may be duetothe increase in the concentration of metabolite in the perfusion medium over the duration of experiment. This in turn may have had an impact on the kinetics of the parent compound metabolism. In the "single pass" experiments, state of equilibrium was not reached, which may be due to the strong binding of the test drug to the liver tissue. Confirmation of this hypothesis is the large distribution volume of verapamil in the liver, amounting 43 ± 16.9 mL / gtissue. The IPRL technique is suitable for determining the hepatic clearance independent of the perfusion method - either "single pass" or "recirculation". In the case of verapamil as a model drug, the hepatic extraction values obtained are close to values found in literature.