Interakcja pomiędzy oksygenazą hemową-1, a rodziną kinaz p38 w regulacji procesu miogenezy

Ostatnie doniesienia wskazują na kluczową rolę oksygenazy hemowej-1 (HO-1) w różnicowaniu komórek progenitorowych mięśni szkieletowych. Oprócz wpływu na poziom typowych markerów różnicowania takich jak MyoD, miogenina oraz miozyna, HO-1 reguluje również aktywność kluczowej kinazy związanej z różnicowaniem mioblastów - p38 MAPK. Kinaza ta posiada cztery różne izoformy, z których dwie (p38α oraz p38γ) w sposób przeciwstawny regulują dojrzewanie mięśniowych komórek progenitorowych, przy czym izoforma α stymuluje, natomiast izoforma γ hamuje proces miogenezy. Uważa się również, iż brak indukcji p38 może być jedną z przyczyn zaburzonego różnicowania komórek mięsaka prążkowanokomórkowego (RMS), złośliwego nowotworu tkanek miękkich charakteryzującego się wysoką ekspresją HO-1. Do tej pory brak doniesień na temat związku pomiędzy aktywacją szlaku przekazu sygnału przez p38, a zależnym od HO-1 zahamowaniem różnicowania mięśni i indukcją nowotworzenia. Aby odpowiedzieć na tak postawione zagadnienie badawcze stworzyliśmy drogą inżynierii genetycznej linie komórkowe mioblastów C2C12 o nadekspresji genów markerowych (GFP lub lucyferazy) oraz o zwiększonej ekspresji aktywnej i nieaktywnej enzymatycznie (o zmutowanej kluczowej reszcie histydyny) HO-1. W celu określenia roli izoform p38 w rozwoju RMS użyliśmy dwóch linii o odmiennym stopniu złośliwości histologicznej (CW9019 oraz SMS-CTR). Zależność wzrostu RMS od kaskady p38 zbadaliśmy również zbadana w doświadczeniu in vivo u myszy bezgrasiczych.Badania dotyczące roli izoform p38 w czasie miogenezy wskazują na zależność ekspresji formy p38γ, ale nie p38α, od aktywności HO-1. W czasie fizjologicznego różnicowania mioblastów, pod wpływem indukcji HO-1 dochodzi do wzrostu fosforylacji kinazy p38 oraz zwiększonej ekspresji p38γ. Nie obserwuje się natomiast zależności poziomu HO-1 od aktywności p38. W przypadku RMS, linia komórkowa o wyższej złośliwości histologicznej (CW9019) charakteryzuje się zwiększoną ekspresją zarówno HO-1 jak i p38γ oraz niższym poziomem p38α w porównaniu z łagodniejszą linią SMS-CTR. Podobnie jak w mioblastach, HO-1 zwiększa ekspresję p38γ. Co więcej, zahamowanie zarówno p38 jak i HO-1 w SMS-CTR zwiększa ekspresję genów markerowych różnicowania mięśniowego. Zahamowanie aktywności HO-1 prowadzi do zmniejszenia szybkości wzrostu guza in vivo i obniżenia ekspresji p38γ.Zdefiniowanie nowych szlaków związanych z różnicowaniem RMS może przyczynić się do znalezienia nowatorskich, bardziej efektywnych form terapii tego nowotworu. Uzyskane wyniki pokazują, że taki efekt może być związany z zahamowaniem ścieżki kinazy MAP p38γ.

Recent reports indicate the pivotal role of heme oxygenase-1 (HO-1) in the differentiation of skeletal muscle progenitor cells. Apart from the impact on the expression of canonical differentiation markers such as MyoD, myogenin, and myosin, HO-1 regulates also the key differentiation-associated MAP kinase – the p38 MAPK. p38 kinase was described to occur in four different isoforms, of which two (p38α and p38γ) display distinct effects during process of myogenesis, first one promoting and the latter one abrogating differentiation. It is also suggested that the lack of induction of p38 may be one of the causes for development of rhabdomyosarcoma (RMS) – a malignant muscle-derived tumor, which is characterized by high HO-1 levels. Up to date, no study aimed to comprehensively examine interaction between different p38 isoforms and HO-1 mediated impairment of myoblasts differentiation and muscle oncogenesis.To address this question we created, by means of genetic engineering, the myoblast cell lines C2C12 with forced overexpression of marker genes (GFP or luciferase) and HO-1, both enzymatically active and inactive (mutated at the critical histidine residue). To examine role of p38α and p38γ in RMS, two different histological types of RMS cell lines with differential clinical aggressiveness (CW9019 and SMS-CTR) were used. RMS growth in regards to p38 expression was also examined in vivo in nude mice.Study of p38 isoforms during induction of differentiation toward mature muscles indicate dependence of p38γ, but not p38α, on HO-1 activity. In normal myoblasts induction of HO-1 leads to increased phosphorylation of total p38 and increased expression of p38γ. On the other hand, expression of HO-1 is not affected by p38 activities. In RMS, cell line of more aggressive histological subtype (CW9019) is characterized by high levels of both HO-1 and p38γ which is accompanied by low level of p38α in comparison to benign SMS-CTR RMS cell line. Like in myoblasts, HO-1 upregulates p38γ expression. Moreover, inhibition of p38 or HO-1 in SMS-CTR facilitates expression of genes associated with myogenic differentiation. Inhibition of HO-1 using tin protoporpyrin IX reduces growth of tumors formed by SMS-CTR cells, what is accompanied by decreased expression of p38γ.Defining new pathways associated with differentiation of RMS may help to find new strategies improving therapy of RMS. Our results indicate that such effect may be related to inhibition of p38γ MAP kinase pathway.